Ньюкаслская болезнь

 Ньюкаслская болезнь- Newcastle disease (ND),Avian pneumoencephalitis, Ranikhet (англ.), Asiatische oder Atypishe Geflugelpest,Newcastle-Kraukheit, Psevdovogelpest (нем.) - (НБ),псевдочума птиц - это  высоко контагиозная вирусная инфекция, главным образом куриных, характеризующаяся пневмонией, энцефалитом, множественны­ми точечными кровоизлияниями и поражением внутренних органов. Зарегистрирована на всех континентах. Относится к особо опасным инфекциям. Её впервые диагностировал и описал Краневельд в 1927 г. на острове Ява.

Сведения о возбудителе. Вирус впервые выделил Кранвельд (1927) и описал Доил (1940).

Морфология и химический состав. Размер вирионов от 120 до300 нм. Оболочка вирионов имеет выступы нити длиной 8 нм и содержит АГ-компоненты. Внутренний компо­нент - нуклеокапсид (G-АГ) представляет собой длинную заостренную пуговку диаметром 13 нм. Структурные единицы - протеины этой трубки (капсомеры) расположены по спирали вокруг центральной оси, внутри них находится РНК. Определен полный геномвируса (12492 основания), выяснена степень структурной однородности у разных штаммов методом "фингерпринта"(отпечатков пальцев). Оказалось, что РНК велогенных штаммов в США (Са-1083 Фонтана и Ларго) обнаружила высокий уровень структурной однородности. Наоборот, при сравнении "фингерпринта" олигонуклеотидов РНК шт. Фонтана и Техас GB выявлена наименьшая степень однородности .

Как патогенные, так и апатогенные штаммы вируса НБ содержат 6 полипептидов: Z, HN, F, M, NP и полипептид с мол. м. 47000 Д. В составе вируса обнаружены 3 основных и 5 минорных белковых компонентов. В какой степени они соответствуют 6 вышеуказанным полипептидам неизвестно. К основным относятся гемагглютинин, белок внутренней оболоч­ки и белок РНП. Нейраминидаза - один из минорных компонентов. Кроме этого, в вирионах вируса НБ обнаружена эндорибонуклеаза, а в вирусе, полученном из хронически инфициро­ванных клетокZ, РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза). Возможно, имеется связь между наличием обратной транскриптазы и способностью вируса вызывать хронически протекающую инфекцию. Очищенный нуклеокапсид не обладает РНК-полимеразной активностью, так как не содержит необходимых белков, либо в процессе приготов­ления препарата нуклеокапсидов инактивируется сам энзим.

Вирионные и целлюлярные полипептиды, обладающие одинаковой электрофоретической подвижностью, идентичны. Неспецифичный вирусный гликопротеин Fo, обнаружен­ный только в зараженных клетках, родствен малому вирионному гликопротеиду F. Поли­пептид NP (мол.м.53 000) из зараженных клеток родственен нуклеокапсидному белку NP. В сумме мол. м. 6-и вирусных полипептидов равна 491000 Д, что соответствует максимальной кодирующей способности геномавируса НБ. Белок Fo играет основную роль в вирулентно­сти вируса. Он синтезируется в виде неактивного предшественника - белка Fo и расще­пляется трипсиноподобным ферментом в трансмембранных комплексах Гольджи на 2 субъ­единицы F1 и F2. Это необходимо для проявления инфекционности и составляет сущность протеолитической активации вируса.

Устойчивость. Инфекционность, гемагглютинирующая активность и иммуногенность вируса разрушаются при 56°С в период 5 мин - 6 ч. При 37°С эти изменения наступают че­рез несколько часов и даже дней, при 20 и 8°С для утраты вирусом своей биологической ак­тивности нужны месяцы и даже годы. Вирус устойчив к низкой температуре, в заморожен­ном состоянии активность его сохраняется более 2-х лет. Нет корреляции между уровнем вирулентности и ГА-активности штаммов вируса при прогревании. Вирус устойчив к рН в диапазоне от 2 до 10, быстро разрушается при воздействии ультразвука. Р-ры формалина (1-2%-ные), гидроксида натрия (1-2%-ные), мыльного крезола (1%-ный) и фенола(3-4%-ные) его быстро убивают. Стабильность вируса в значительной мере зависит от среды, в которой он находится Под воздействием дневного света инфекционность его снижается за 4 ч на 3-5 lg ГА свойcтва сохраняются при более длительной инактивации, чем инфекционные. Установлено, что висцеротропные велогенные штаммы обладают термочувствительным, а лентогенные - тер­мостабильным ГА, т.е. вирулентность штаммов прямо не связана с термостабильностью ГА.

Антигенная структура. Вирус содержит гемагглютинин инейраминидазу, М-, F-белки и S (РНП) - антигены, различающиеся по локализации в вирионе, иммуногенности и АГ-активности. Каждый вирион содержит определенное число идентичных молекул HN, каждая молекула HN содержит 2 домена' НА и NA.Каждый домен содержит идентичные или от­личные друг от друга АГ-детерминанты(эпитопы). В молекуле F-протеина выявлено 4 различных АГ-сайта. AT к сайтам 1,2 и 3 предотвращают вирус индуцированный ге­молиз эритроцитов птиц. AT к сайту 4 ингибируют или гемолиз, или разрушение клеток АГ-активность F-протеина высококонсервативна, поэтому рекомбинантные штаммы, экспрессирующие белок F,желательны в качестве кандидатов для живых вакцин. Кроме того, при вакцинацииптицы белком F можно легко дифференцировать иммунный ответ, индуци­рованный вакцинацией, от иммунного ответа, связанного с инфекцией. В противополож­ность F-белку, ГА и нейраминидаза обладают выраженной АГ-изменчивостью. Различия в вирулентности штаммов вируса НБ связаны с изменением в структуре HN-гена,кодирующего ГА-нейраминидазу. Большинство аминокислотных замен располагается в четырех участках N-конца HN-белка. Имеются, свидетельства о связи вирулентности вируса НБ с расщеплением гликопротеина слияния (белка Fo) клеточными протеазами, или изменением других свойств белков F и HN.

Антигенная активность. Гликопротеидный ГА-нейраминидазный комплекс вируса (шт. La-Sota) обладает выраженной АГ- и протективной активностью на курах. Большинст­во исследованных клонов монАТ против ГА-нейраминидазы вируса НБ в равной степени вызывают оба варианта слияния.

Антигенная вариабельность и родство. Подавляющее большинство полевых и вак­цинных штаммов вируса НБ в АГ- и иммунобиологическом отношениях сходно. Некоторые природно-ослабленные штаммы (F, Bl, La Sola, КД, Beaudette,Бор/74/ВГНКИ и др.) широ­ко используют в качестве живых вакцин. Установлено различие природных штаммов не только в вирулентности, но и значительное различие в тропизме к нервной, легочной и энтеральной тканям. Показано, что при серийном пассировании (37°С, 120 ч) не разведенного вируса НБ в КЭ продуцируется избыточное количе­ство ГА; образование "неинфекционных" частиц является, следствием множест­венной инфекции клеток; неинфекционный ГА формируется в результате интерференции при созревании активного вируса с вирусом неполным, инфекционность вируса более чувст­вительна к термальной инактивации, чем его ГА-активность.

Локализация вируса. Вирус локализуется в паренхиматозных органах, костном и го­ловном мозге, мышцах, трахеальной слизи, толстом и тонком кишечниках, содержится в различных выделениях. В период выраженной клинической картины болезни в изобилии выделяется во внешнюю среду с фекалиями, трахеальной слизью и выдыхаемым воздухом Вирус, как правило, можно выделить только в начале болезни. Переболевшие птицы могут долго быть вирусоносителями. В организме неиммунных птиц вирус НБ обнаруживался через 24-48 ч и далее в течение 10 дн во всех органах и тканях. У иммунных или частично иммунных птиц наиболее продолжительное время (19 дн) вирус выделяли из железистого желудка, лимфоидных образований слепой кишки, фабрициевой сумки и мозга. Поскольку ни один из ука­занных органов не отличался в отношении тропизма вируса, то в полевой диагностике ре­комендуется исследовать все четыре органа. При наличии циркулирующих ATвирус иногда удается выделить из мозга переболев­ших птиц Показано, что вирулентные штаммы могут бессимптомно персистировать в орга­низме иммунных птиц в течение 70 дн. Нет зависимости между титрами аити ГА и степе­нью выделения вируса во внешнюю среду. С увеличением продолжительности вирусоносительства (выше 70 дн) вирулентность исходных штаммов вируса снижается независимо от первоначального титра анти-ГА, однако латентная форма инфекции может свободно пере­ходить в клинически выраженную. Было показано, что после заражения иммунизированной птицы велогенным вирусом возможно носительство и выделение последнего в течение 14-17 дн, т.е. поствакцинальный иммунитет не исключает циркуляции дикого вело- или мезогенного вируса. Возможность длительной персистенции вирулентного вируса в организме вак­цинированной птицы может обусловливать возникновение вирусоносительства.

Изучено in vitro связывание шт. V4 вируса НБ с клетками различных отделов пищева­рительного тракта цыплят. Оказалось, что энтероциты 12-перстной, тощей, повздошной, слепой и прямой кишок связывали 97, 85, 99, 92 и 90% вируса соответственно, в то же вре­мя к энтероцитам пищевода, зоба и железистого желудка вирус не прикреплялся, поэтому и инфекционность супернатанта не изменялась.

Антигенная активность. Все формы НБ вызываются идентичными в АГ-отношении штаммами и протекают с образованием ВНА, анти-ГА и КСА В сыворотке птиц AT появ­ляются через 6-10 дн после заражения, пока еще у больной птицы проявляются клинические признаки болезни. Наивысший титр их отмечают через 3-4 нед. Снижение титра AT обычно происходит медленно и становится заметным через 3-4 мес, а спустя 8-12 мес AT уже не выявляются. Установлена корреляция между анти-ГА и ПА. Низкий процент птиц (до 12) с ПА указывает на наличие в стаде выраженного иммунитета против НБ, а высокий процент (более 50) свидетельствует о персистентной инфекции.

Получены раздельно AT на гликопротеин ГА-нейраминидазы (ГП-ГН) и на гликопротеин слияния (ГП-С). Первые из них подавляют ГА- и нейраминидазную активность вируса НБ и тормозят его гемолитическое действие, ATна ГП-С не влияют на его первые две ак­тивности, но подавляют его гемолитическую активность и тормозят эффект вирусиндуцирсванного слияния клеток. Шт. 575, выделенный от диких лебедей и королевских крачек в Ка­наде,обладал уникальной способностью вызывать образование не только анти-ГА, но иAT, блокирующих элюцию вируса с эритроцитов.

Экспериментальная инфекция. Легко воспроизводится на курах,цыплятах и индю­шатах вирулентными штаммами при любом методе заражения. Вся зараженная велогенными штаммами птица, не имеющая пассивных материнских AT,погибает. Мезогенные штаммы (подобные вакцинному вирусу Н) вызывают летальный исход у цыплят до 45-60-сут возраста. Среди взрослой птицы отход достигает 25-30%. Наблюдают параличи и парезы. У кур-несушек яйценоскость прекращается на 25-30-й день.

Лентогенные штаммы (Bl, F, La Sola, Бор/74/ВГНКИ) вызывают у цыплят слабую или инаппарантную форму болезни. Даже при интрацеребрально заражении цыплята не гиб­нут, КЭ также не гибнут ранее 100 ч после введения минимальной летальной дозы.

Кроме кур и цыплят к экспериментальному заражению восприимчивы перепела, воро­бьи, тетерева, голуби. При парентеральном заражениине которые штаммы оказались пато­генными для морских свинок, кошек, собак и других млекопитающих. Интраназально и интрацеребрально удается заразить и золотистых хомячков. Вопрос о трансвариальной пере­даче вируса НБ однозначно не решен. Однако факты последних лет свидетельствуют о воз­можности такой передачи. Так, например, в содержимом желудка очень молодых не вакци­нированных цыплят были обнаружены лентогенные штаммы вируса. Последний обнаружи­вался даже в КЭ, несмотря на присутствие материнских AT. Поствакцинальные титры AT низки и вариабельны у цыплят, предварительно инфицированных вирусом НБ.

Культивирование. Помимо восприимчивой птицы вирус культивируется в КЭ при лю­бом способе заражения, на изолированных ХАО, в культуре фибробластов КЭ, некоторых первичных и перевиваемых клетках. Через 48ч вирус (шт. R2B) накапливался в значительных количествах в ХАО и в низ­ких титрах определялся в аллантоисно-амниотической жидкости. Если эмбрионы инкуби­руют до 60 ч, то вирус выходил из ткани мембран и накапливался в экстра эмбриональной жидкости. В клетках ВНК-21 М-белок вируса НБ обнаруживался в цитоплазме с 5-го ч после инфицирования.

Цитопатология заражённой культуры клеток. Вирус развивается в культурах кле­ток 18 первичных и 11 перевиваемых линий, вызывая цитологические изменения. Репро­дукция его в культуре тканей сопровождается уплотнением цитоплазмы клеток, появлением в них вакуолей и вирусных частиц.Через 40 ч в цитоплазме некоторых клеток обнаружива­ли множество малых аморфных эозинофильных включений, окруженных прозрачной зоной. В одной клетке могло быть до 12 (и более) таких включений. Через 2 дня в зараженных культурах увеличивалось количество клеток с пикнотическим ядром, а через 7 да поража­лись все клетки.

ГА свойства. Вирус агглютинирует эритроциты амфибий,рептилий, птиц, человека, мышей и морских свинок. Эритроциты КРС, овец, коз,свиней и лошадей агглютинируются не всеми штаммами вируса. Разнообразие в агглютинабельности эритроцитов КРС зависит от ионной силы, концентрации солей и рН р-ра. Инагглютинабельность эритроцитов опре­деленных видов объясняется,вероятно, быстрой элюцией с них вируса. Приблизительно 105 инфекционных единиц (ИД 5о) вируса равны 1 ГА.Некоторые штаммы вируса теряют ГА-активность при 56°С за 5 мин, сохраняя инфекционные свойства, другие, наоборот, сохраняют ГА-способность после прогревания при 56°С в течение 180-240 мин, а инфекционная активность их утрачивается через 90 мин Для отдельных штаммов НБ характерна опреде­ленная температура, при которой они утрачивают ГА-активность. Это свойство можно ис­пользовать для дифференциации штаммов. ГА лентогенного шт. В1 в инфицированных клетках ХАО накапливаются к 12 ч культивирования в более низких титрах (1:16 - 1:32), чем ГА велогенного (Т/53) штамма (1:64 - 1:128). Вирус НБ, выращенный в КЭ, состоит из инфекционных и неинфекционных ГА частиц. У этих 2 типов частиц изучены структурные белки, ГА- и нейраминидазная активности, полипептидный состав жирных кислот в липидах мембраны. Фиксация эритроцитов цыплят гаотеральдегидом не снижает их агглютинабельности по отношению к вирусу НБ. Фикси­рованные таким образом эритроциты можно использовать в РГА и РТГА после хранения при температуре 4°С в течение 2 мес. Велогенные штаммы отличаются от лентогенных по ГА-свойствам. Дифференциация указанных возбудителей - обра­ботка их в течение 1 ч азотистой кислотой при рН 4 и температуре 37°С.

Нейраминидазная активность. Выявлена обратная корреляция между нейроминидазной активностью и вирулентностью штаммов вируса. Считают,что параметры энзиматической активности могут являться маркерами вирулентности вируса in vivo.

Гемолитические свойства. Все штаммы вируса обладают гемолитической активно­стью по отношению к эритроцитам морских свинок, лошадей и кур, которая не связана с вирулентными свойствами и находится в прямой зависимости от ГА-титра вируса. Однако имеется и противоположное мнение. По гемолитической активности штаммы вируса НБ можно разделить на слабоактивные (Sи М) и высокоактивные (Т, Н и В). На гемолитические свойства вируса влияют концентрация солей, рН и температура среды, вид эритроци­тов. При 4°С она резко снижается. Гемолитические свойства вируса можно инактивировать специфической анти сывороткой и формалином.

Токсические свойства. Токсичность вируса зависит от метода введения вируса: интрацеребрально, интраназально, внутривенно. У кроликов,зараженных в мозг, в первые 2 дн развиваются параличи, и к исходу 3 сут животные гибнут. При внутривенном заражении кроликов вирус вызывает пирогенную реакцию, могут появиться лимфоцитопения и лихо­радка. У мышей при интраназальном введении развивается летальная пневмония, а после повторных интраназальных введений -гепатизация легких. После замораживания-оттаивания вируссодержащейэкстраэмбриональной жидкости или обработ­ки ее in vitro гомологичной иммуносывороткой токсические свойства вируса исчезают.

Интерфероногенные свойства. Многие штаммы, особенно шт. Н, -хорошие индукто­ры интерферона. Выделены ts-мутанты этого вируса и изучена их способность индуцировать интерферон в первичных клетках КЭ. Показано, что 5%вирусного генома, связанного с инфекционностью, необходимо для индукции интерферона. Существенную роль в индукции интерферона играет ранняя транскрипция(2-3 ч после заражения) генома вируса. Способ­ность индуцировать интерферон у интактных вирионов НБ, инактивированных р-пропио-лактоном от вирионов и некоторых структурных компонентов сравнивали в тест-системе Р/3 ML - интерферон продуцирующих клеток.

Вирулентные свойства. По вирулентным свойствам все выделенные и охарактеризо­ванные штаммы вируса НБ разделяются на велогенные (Т,Сато, Миадера и др.), мезогенные (Н, Комаров, Муктесвар, Роакин и др.) и лентогенные (В 1, F,La Sola,Бор/74/ВГНКИ). Велогенные штаммы отличаются от лентогенных по уровню репродукции и спектру инвазивности. Они накапливаются в органах больных цыплят(легкие, селезенка, печень, мозг) в концентрации 5,5 lg ЭЛД 5о/г, лентогенные же штаммы (Bl, La Sota)в мозге не выявляют­ся, а уровень накопления в легких и селезенке не превышает 2,5 lg ЭЛД 50/г.. ЦПА велогенных штаммов обычно соответствует инфекционностидля КЭ, тогда как лентогенные штам­мы ЦПА не обладают.

С помощью метода фингерпринта можно идентифицировать высокопатогенные штаммы вируса, имеющие очень близкое АГ родство, а также определять корреляцию между нали­чием специфических олигонуклеотидов и патогенностью. Разработан культурально-тканевый метод дифференциация мезовелогенного и других штаммов вируса НБ, основан­ного на изучении характеристики ЦПД штаммов вируса, их инфекционных титров в культу­ре клетокLSGFS-SF3. Лентогенные штаммы в этой культуре клеток продуцируются в низ­ком титре и ЦПД их слабо выражено. Получены также мои AT, пригодные для штаммовой дифференциации. Для дифференциации лентогенных штаммов вируса НБ применяют РГА- элюции. Эти штаммы можно разделить на две группы: быстро (-24R) и медленно(+24R+) элюирующие. Кроме того, используют тест термо стабильности ГА и среднюю смертность зараженных КЭ.

Эпизоотологическая характеристика.Источники и пути передачи инфекции. Источник инфекции - больная птица. Зараже­ние происходит при контакте больной птицы со здоровой, а также через инфицированную воду и пищевые отходы. Особенно быстро инфекция распространяется аэрогенно. Больная птица через 2 дня после заражения и за день до появления клинических признаков болезни выделяет вирус с выдыхаемым воздухом, во время кашля. Распространение инфекции на большие расстояния (по воздуху до 15 км) связано с пе­ревозкой птицы, тушек вынужденно убитой птицы, инфицированной тары, яиц из неблаго­получного хозяйства, а также не обезвреженной одежды, обуви. В яйцах, собранных от боль­ной птицы, зародыш при инкубации погибает от вируса.

Имеются данные о передаче вируса через некоторых паразитов,в частности E.tenella, E. noeca-trix. Такую же роль могут играть кокцидии. Было доказано, что после заражения ви­русом цыплят, которые до этого были инвазированы половозрелыми или развивающимися формами Ascaridae galli, вирус внедрялся в паразитов и его можно было выделить. Особую важность имеет наличие вируса в яйцах A.galli, в которых он может длительное время со­храняться и передаваться восприимчивым птицам. В Австралии проведена оценка патогенности 45 изолятов вируса НБ, циркулирующих в настоящее время. Все патогенные изоляты передавались путем контакта.

Спектр патогенности в естественных условиях. В естественных условиях вирус вы­деляли от домашних разных видов (индейки, цесарки, утки),синантропных (голуби, воро­бьи, галки) и диких птиц. В 1979 г. от попугаев (KatakoeSulpurea) выделен велогенный штамм (GND-1) вируса НБ. В 1-5% случаев вирус выделяли из клоаки водоплавающих птиц. В 1982 г от японского ястреба-перепелятника (Accipiter Virgatus golans) выделен ва­риант вируса НБ, отличающийся температурочувствительностью в РГА; он вызывал ГА только при 4°С, а не при 25 или 37°С В 1980 г в Бельгии выделен вирус от голубей, все штаммы его оказались лентогенными Высказано предположение о том, что голуби - естест­венные носители лентогенных штаммов.

В литературе приведены случаи заражения людей вирусом НБ,которые, главным обра­зом, могут быть при нарушении гигиены на предприятиях и индивидуальной гигиены пер­сонала. У больных лиц развивался конъюнктивит.Имеются сведения об эпизоотологических особенностях и клинической картине НБ сре­ди голубей в некоторых районах Судана в 1982 г. Клинически эта болезнь характеризова­лась внезапным угнетением, потерей аппетита, нервными явлениями, неспособностью ле­тать. В ряде хозяйств летальность среди голубей достигала 100%. Выделенный вирус не от­личался от прототипных штаммов вируса НБ. В течение 1984 г.в Австрии резко возросла инфицированность голубей вирусом НБ. В 1990-1991 гг. при серологическом определении AT против вируса НБ у водоплавающих (уток игусей) с помощью РТГА и ИФА показано, что AT в РТГА выявлены у 3,1% мускусных и10% пекинских уток, по ИФА - у 20,3 и 24,8% соответственно. В 1970-1972 гг. в Голландии погибло большое количество норок от менингоэнцефалита. Причиной смертности был вирус НБ Выделенный на КЭ, он обладал низкой патогенностью для норок при интрацеребральном введении. Оказывается, животные заражались при по­едании потрохов инфицированной птицы, среди которой в это время наблюдалась НБ. Описан случай острого респираторного заболевания у 3-мес дрофы вихляя в Таифе(Саудовская Аравия). Из легких, селезенки и трахеи пораженной птицы был впервые выде­лен вирус НБ и вирус оспы птиц.

Клинические
признаки и патологоанатомические изменения. При естественном
течении ин­кубационный период длится от 5 до 15 дней (в среднем 5-6 дней).
Симптомы болезни довольно разнообразны.
Описаны четыре формы клинического проявления болезни. При первой велогенной
форме наблюдают угнетение, слабость, расстройство функции органов дыхания,
диарею с появлением водянистых зеленоватых фекалий с примесью крови, тремор,
опистстонус. Возможны параличи лап и крыльев, а также гибель птицы без каких-либо
признаков. Смертность достигает 90%. Основной патологоанатомический признак -
геморрагическое поражение пищеварительного тракта. Полагают, что эта форма
болезни вызывается высокопатогенными (велогенными) азиатскими штаммами вируса. Велогенная
висцеротропная НБ с летальностью до 100% в 1966 - 1973гг. получила эпизоотическое
распространение, особенно в Европе и США.Вторая форма
болезни характеризуется поражением, главным образом, органов дыха­ния (кашель,
удушье) и нервной системы. Погибает от 10 до 50% заболевшей птицы. Среди цыплят
гибель достигает 90%. Пневмоэнцефалит с летальностью до 100% был широко рас­пространен
в Западном полушарии в 1940-1950гг., в настоящее время регистрируется очень
редко. Старая птица погибает редко. Некоторые мезогенные штаммы, вызывающие эту
форму болезни, до сих пор используются в качестве вакцинных (шт. Н, Комаров и
др).Третью наиболее
легкую форму болезни вызывают лентогенные штаммы вируса. На­блюдают
незначительные изменения респираторного игерминативного трактов (оофориты и
сальпингиты). Яйценоскость прекращается на 7-22-й день, снижается аппетит,
легкий ка­шель можно услышать ночью. Четвертая - асимптоматическая форма
протекает без признаков и заболе­вание часто определяется серологически или
выделением вируса.При вскрытии
трупов птицы, павшей при остром течении болезни, обнаруживают вос­паление
слизистых оболочек носа и ротовой полости, полосчатые кровоизлияния на слизи­стой
оболочке пищевода, зоб переполнен слежавшимися или жидкими кормовыми массами,
слизистая оболочка желудка покрыта слизью. На границе железистого и мышечного
отделов желудка видны кровоизлияния в виде пояска. В тонком кишечнике наиболее
характерны очаги некроза и эрозии вокруг пейеровых бляшек, в толстом -
везикулярные папулы, эрозии и изъязвления на всем протяжении слизистой
оболочки. Селезенка в состоянии атрофии. На слизистой ротовой полости, пищевода
и пилоруса - изъязвления, эпителий либеркюновых желез дегенерирован и слущен,
вокруг расширенных и некротизированных крипт в слизи­стой оболочке тонкого
кишечника скопление слизистого секрета и выпотевание нейтрофилов. Атрофия и
некроз обнаружены в селезенке, печени, солитарных лимфоузлах и тимусе.
Изменения в печени непостоянны. Селезенка поражается довольно часто. Она
увеличена, бледная, пятнистая. Яичники гиперемированы, лицевые клетки
увеличены, иногда разорва­ны, и желточная масса находится в брюшной полости. В
сердечной мышце заметны крово­излияния, в полости сердечной сорочки экссудат.
Слизистые оболочки гортани и трахеи катарально воспалены. Характерно поражение кишечника:
острый катар, резкая гиперемия, кровоизлияния, наличие фибринозно-некротических
участков. Последние часто встречаются в двенадцатиперстной и тонкой кишках.
Иногда поражается весь кишечник. Точечные и пятнистые кровоизлияния
обнаруживают у 50-70 и даже 90% больных кур в двенадцатипер­стной, прямой и
слепой кишках. Изменения в печени носят непостоянный характер. У от­дельных
цыплят она увеличена, полнокровна, темно-вишневого цвета, иногда с единичными
точечными геморрагиями под капсулой. Желчный пузырь наполнен желчью темного
цвета, а на слизистой оболочке иногда отмечают точечные кровоизлияния и
некротические очаги. Почки полнокровны и отечны. Селезенка нормальной величины
или уменьшена в размере. Слизистые носовой полости, гортани и трахеи гиперемированы,
с мелкими точечными кро­воизлияниями, нередко с дифтерийными наложениями.
Легкие у большинства кур бывают воздушными, светло-розового цвета, иногда с
явлениями застойной гиперемии и отека. В перикарде и грудобрюшной полости
небольшое количество жидкости светло-соломенного цвета. Сердечная мышца темного
цвета, дряблая, полнокровная, иногда с мелкими точеч­ными кровоизлияниями в
области эпикардиального жира. В мозге яв­ления отека и гиперемии, в отдельных
случаях точечные кровоизлияния в твердой и мягкой мозговых оболочках и веществе
мозга.Гистологические
изменения. Постоянно обнаруживают поражения в железистом же­лудке и по всей длине
кишечной трубки. Слизистая оболочка резко утолщена за счет отека и клеточной
инфильтрации и находится в состоянии выраженного десквамативного катара.
Покровный эпителий и эпителий крипт подвергаются дистрофии, некрозу и слущиванию
в просвет. Крипты в форме вытянутых мешковидных бесстуктурных образований,
окрашен­ных в серо-синеватый цвет. Соединительнотканные волокна подслизистого
слоя сильно раз­двинуты в результате воспалительного отека и инфильтрации
лимфоцитами и другими кле­точными элементами. Закономерно для НБ - некротические
поражения толстого кишечни­ка. Отмечают также сильное развитие клеточно-пролиферативных
реакций в ЦНС и внут­ренних органах, по ходу капилляров и мелких сосудов, а в
веществе мозга со стороны кле­ток микроглии -образование глиозных узелков.
Кроме того, встречаются тигролиз, вакуо­лизация цитоплазмы и ядра, хроматолиз и
гибель нейронов. В селезенке, печени, почках и ЖКТ пролиферативные явления
вокруг сосудов, в междольковой, межканальцевой и подэпителиальной
соединительной ткани. В селезенке резкая гиперплазия фолликулов, утолще­ние и
фибриноидный некроз стенок сосудов с развитием околоконцевых артерий очагов
крупноклеточной пролиферации с некрозами в центре их и отложением фибрина. В
почках - признаки некробиоза эпителия канальцев и картина тяжелого нефроза. В
легких - явления застойной гиперемии и отека и редконекротическая пневмония.
Описанная картина вскрытия и гистологические изменения характерны для классиче­ского
проявления НБ при заражении велогенными штаммами. Из многочисленных наблю­дений
установлено, что течение инфекции с поражением нервной системы или
респираторного тракта без острого септического процесса чаще вы­зывается
вирусами с природно ослабленной вирулентностью.Патогенез. Вирус, проникая в организм, размножается
в клетках эндотелия, в результа­те чего клетки кровеносных сосудов
разрыхляются, нарушается их порозность и в них раз­виваются
воспалительно-некротические процессы. Через 24-36ч. вирус локализуется в па­ренхиматозных
органах, костном и головном мозге, кишечнике и мышцах, вызывая наряду с
расстройством гемодинамики тяжелые некрозо-дистрофические изменения.Диагноз. При характерном течении болезни
постановка диагноза не представляет сложности. При вспышке болезни на фоне
пассивного или поствакцинального иммунитета, а тем более в стационарно
неблагополучном хозяйстве поставить диагноз бывает чрезвычайно трудно. В этих
случаях тщательно изучают эпизоотическую ситуацию, клиническую и
патологоанатомическую картину. Решающее значение имеют лабораторные
исследования - выделение ви­руса на КЭ, его индикация и идентификация в РГА -
РТГА, определение вирулентности ви­руса на КЭ и цыплятах, а также выявление AT
в сыворотке переболевших или вакциниро­ванных птиц в РТГА.Выделение вируса. Вирус, в зависимости от его тропизма
можно выделить из головного и костного мозга, трахеи, кишечника, селезенки,
легких, печени. Для исследования рекомендуется брать голо­ву, легкие, трахею и
селезенку от только что павших или вынужденно убитых птиц. Вирус удается
выделить только в период вспышки болезни. Через 15 дн. выделить его обычными
методами, как правило, не удается. Поэтому патологический материал необходимо
брать в начале вспышки (в первые 3-5дн.) и направлять в лабораторию в термосе
со льдом. Внут­ренние органы можно помещать в стерильный 50%-ный р-р глицерина
на дистиллирован­ной воде. Смывы из трахеи и клоаки лучше консервировать на
холоде или при температуре не выше 4°С. Мазки-отпечатки исследуют методом ФА,
срезы - с помощью ЭМ или ИЭМ, а суспензию - в РГА. Это позволит выявить
специфический АГ (вирус) и ГА-агент в течение 3-5ч, определить направленность
дальнейших исследований.Заражение КЭ. Эмбрионы 9-11-дн возраста заражают по 0,2
мл., не менее 10 КЭ на ка­ждый материал, в аллантоисную полость общепринятым
методом и инкубируют 72ч. при 37,5°С (погибших в первые 24ч. эмбрионов не
учитывают).Если через 72ч. нет погибших КЭ, то 5 из партии зараженных убивают,
оставляя их при 4°С на ночь. Остальные 5 КЭ ин­кубируют до 120ч. и затем
убивают. Аллантоисную жидкость от погибших и живых КЭ проверяют на ГА в РГА с
куриными эритроцитами (1-5%-ная взвесь). Обычно велогенные штаммы вируса
вызывают гибель КЭ уже через 32-60ч. после заражения, мезогенные - че­рез
60-90, а лентогенные - через 100ч. и более. Иногда при первом пассаже не
удается выде­лить вирус, поэтому необходимо провести не менее 3-х
"слепых" пассажей. Учитывая, что в вакцинируемых стадах можно
выделить и вакцинный вирус (шт. Н, La Sota , Бор 74/ВГНКИ и др.), вторым этапом
исследования должно быть определение патогенности выделенного изолята. Первым
ориентиром могут служить данные РГА. Обычно полевые изоляты обла­дают низкой
ГА-активностью, проявляя ее в разведениях 1 16 - 1.128, тогда как вакцинные
штаммы, наоборот, проявляют высокий ГА-титр - 1-256 - 1-2048.Ненадежным
оказался метод выделения вируса от зараженных иммунных кур: чем вы­ше иммунитет
у несушек, тем меньше вероятности выделения вируса из их эмбрионов. При
исследовании большого количества полевых образцов на выделение вируса НБ можно
ис­пользовать фрагменты ХАО, связанные с яичной скорлупой. Для этого фрагменты
ХАО размером 0,6-1,0 см2 культивируют в среде Игла. Эффективность выделения
вируса 97%. При внесении вируса в среду культивирования, или непосредственно на
ХАО, КЭ получены совпадающие результаты.Заражение
культуры клеток. Выделение вируса в культуре клеток осуществляется редко, так
как культуральный вирус по ГА-активности значительно уступает эмбрионально­му.
Однако в тех случаях, когда в лаборатории можно получить культуру фибробластов
КЭ и специалисты владеют этим методом, его можно применять для выделения и
идентифика­ции вируса. Приготовление вирусной суспензии, выращивание и
заражение культуры клеток куриных фибробластов производят общепринятым методом.
Можно использовать переви­ваемые линии ВНК-21и Нер-2.В зараженной
культуре фибробластов КЭ вирус НБ через 48-60ч. вызывает ЦПИ, спе­цифичность
которых подтверждается реакцией гемадсорбции с эритроцитами кур. С вирус-содержащей
культуральной жидкостью может быть поставлена РГА в отношении эритроци­тов
крови кур. Обычно при первичном выделении ГА-титр культурального вируса не пре­вышает
1:32- М28. Отсутствие или низкие титры ГА вируса в первом пассаже на культуре
ткани, не дают основания исключить НБ.Заражение птиц. Если КЭ под руками нет, вирус можно
выделить на неиммунной к НБ птице. Для этого испытуемый материал Г10 (0,5 мл.) внутримышечно
инокулируют цыпля­там в возрасте 2-4 мес. За инфицированной птицей наблюдают
10-12 дн. При появлении ха­рактерных для болезни симптомов птиц в агональном
состоянии убивают и берут пробы го­ловного мозга и селезенки, которые
используют для заражения КЭ и иммунологической пробы (для одновременного
заражения птиц иммунной и неиммунной групп).Титрование вируса. Обычно проводят на КЭ, культурах клеток по
общепринятой ме­тодике и на 6-10 нед. цыплятах. Доза инокуляции вируса для цыплят
0,5 мл (внутримышечно или внутривенно). Срок наблюдения 15 дн.Индикация вируса. Экспресс-методы выявления антигена вируса
НБ. Через 24 ч. винфицированных культурах клеток (шт. Н) наблюдают появление
многоядерных симпластов и цитоплазматических эозинофильных включений
неправильной глыбчатой формы. Через 48 ч после заражения цитоплазма бывает
нафарширована тельцами-включениями. В ядрах изменений не отмечалось. Разработан
высокочувствительный авидин-биотиновый ИФА. В данном тесте применяют мон АТ к вирусу
НБ, очищенные и меченые биотином. Тест характеризуется простотой выполнения и
короткими сроками (3-4 ч.) получения результатов. Непрямой точечный вариант ИФА
является быстрым, легким, специфическим методом обнаружения вируса в смывах с
различных органов.Для
идентификации РНК вируса НБ пользуются экспресс-методом ПЦР, амплифицирующей
участок длиной 238 п.н. в гене белка слияния F с использованием в качестве
праймеров нуклеотидов, фланкирующих последовательность.В организме
птицы, зараженной вирусом НБ, в процессе продолжительного контакта с вирусом
эритроциты теряют способность ГА (становятся инаглютинабельными). Чтобы кос­венно
доказать присутствие вируса в организме, от исследуемой птицы берут 0,04 мл
крови в формалинизированую (0,1%-ную) вируссодержащую аллантоисную жидкость,
вирус дол­жен обладать высокой агглютинирующей активностью. Если на стекле
наступает гемагглютинация, это свидетельствует об отсутствии в исследуемой
капле крови вируса НБ. Учет ре­акции ведут через несколько секунд. Метод
применим для выявления патогенного вируса в вакцинированном стаде, так как
вакцинные штаммы лентогенной группы инагглютинабельности эритроцитов не
вызывают.РГА. Используют с целью ориентировочного определения присутствия
вируса в иссле­дуемом материале и для его титрования. ГА вируса входят в состав
вирусной частицы (вириона) и могут содержаться в инфицированных аллантоисной и
амниотической жидко­стях, оболочках и органах КЭ, легких, печени, почках и
селезенке погибшей птицы, в жид­кой и клеточной фракциях тканевых культур.
Можно брать эритроциты крови кур, морской свинки, лошади, человека и др. Разные
виды вирусов и даже шт. одного и того же вируса могут отличаться друг от друга
способностью агглютинировать эритроциты указанных жи­вотных. Спектр ГА служит
характеристикой биологической активности вируса и штаммов. Например, большинство
шт. вируса НБ не вызывает ГА эритроцитов лошади, чем отличает­ся от вируса
классической чумы птиц, который способен ГА их в высоких разведениях.
Предложена экспресс-диагностика атипичных форм НБ кровекапельной реакцией
гемагглютинации (ККРА). Простота постановки её, совмещение исследований на НБ и
пуллороз-тиф, позволяют включить ее в технологический процесс ветобработки
птицы.Серологическая идентификация. РТГА. Основной, высокоспецифичный и
простой в выполнении метод идентификации вируса НБ. Для постановки необходимо
иметь эталонные специфические сыворотки к виру­су и выделенный на КЭ вирус
(аллантоисная жидкость) РТГА ставят общепринятым мето­дом в макро- и
микровариантах. Идентификацию вируса считают завершенной, если эта­лонная
специфическая сыворотка тормозит ГА-активность вируса в пределах целого или
1/2-1/8 титра с гомологичным эталонным АГ. Для быстрой идентификации
выделенного вируса рекомендуют следующий метод: на предметное стекло наносят
капли аллантоисной жидкости и 1%-ную суспензию куриных эритроцитов. Затем
ставят пробу на нейтрализацию ГА-активности. Для этого на предмет­ное стекло
наносят каплю той же аллантоисной жидкости, каплю эталонной специфической
сыворотки и хорошенько перемешивают. Если агглютинации эритроцитов нет, значит
вы­деленный вирус является вирусом НБ.Приготовление гипериммунных сывороток. 5-8-мес кур с титрамианти-ГА поствакци­нального
иммунитета против НБ 1:4-1:64 гипериммунизируют вирус-вакцинами из шт. В1, La Sola, Н. Первое введение делают с адъювантом (автоклавированная
смесь ланолина с вазелином в соотношении 1:1,5). На 1 мл. смеси добавляют 5 мл
вакцинного вируса. Смесь растирают в ступке и помещают в водяную баню на 30 мин.
при температуре 56°С.1-й раз вакцину
вводят с адъювантом в объеме 1 мл. внутримышечно, 2-й раз - через 3 дня без
адъюванта, 3-й раз еще через 3 дня без адъюванта. Через 10 дн. проверяют актив­ность
гипериммунных сывороток. Титр их обычно составляет 1:6144-1 12288.РН на КЭ. Используют для идентификации вируса редко, так как она
трудоемка и дли­тельна. Реакцию используют в спорных ситуациях. РН ставят общепринятым
методом обычно в варианте разведения вируса и постоянной дозы сыворотки.
Реакцию считают по­ложительной при индексе нейтрализации >21g.РСК. В диагностической практике при НБ используют редко. Предложена
РСК как бы­стрый и дешевый метод дифференциации штаммов вируса НБ по вирулентности.РИФ. Метод основан на применении рода минсульфохлорида для конъюгации
иммун­ной сыворотки к вирусу с целью идентификации вирусного АГ в пораженных
клетках пав­ших и убитых птиц. Применение этого красителя наиболее приемлемо и
удобно благодаря яркому оранжево-красному свечению АГ. ФИТЦ-конъюгаты
(флюоресцеинизотиоцианат) менее пригодны. Для обнаружения специфического АГ
применяют гомологичные РСХ-конъюгаты общепринятым методом. В большинстве
случаев АГ выявляется в ядрах клеток белой крови (лимфоцитах, моноцитах,
псевдоэозинофилах и эозинофилах) или пораженных клеток указанных органов в виде
яркой флюоресценции оранжево-красного цвета. В кон­трольных препаратах,
обработанных теми же гомологичными конъюгатами, подобного све­чения не
наблюдается, лишь в некоторых случаях выявляется точечное желто-оранжевое свечение
в цитоплазме юных эозинофилов. Установлено, что вирусный АГ в зараженных
культурах клеток (ФЭК иВНК-21) выяв­ляется, начиная с 4 ч. (для велогенных
штаммов) и с 6 ч (для лентогенных штаммов), до 10-12ч. свечение АГ отмечали
только в цитоплазме, а через 20 ч. - в цитоплазме и ядрах клеток.РИГА. Во ВНИВИП разработана методика получения высушенных стандартных
высо­кочувствительных и специфических эритроцитарных тест-препаратов с AT к
вирусу НБ для экспресс-диагностики. Указанный эритроцитарный диагностикум
позволяет выявить вирус в экскретах органов и тканей .ИФА. Методом ИФА вирусный АГ выявляют в ранние сроки после заражения
до появ­ления ЦП Д. Через 12ч. после заражения видны единичные АГ-содержащие
клетки.Идентификация при помощи монАТ. Исследованы различные штаммы вируса и изоляты
НБ на гомологичное родство к монАТ. В результате тестирования 40 изолятов и
штаммов с использованием набора из 9 монАТ  выявлено 8 групп. Вирусы каждой группы
обладали не только общими АГ-свойствами, но и одинаковыми эпизоотическими чертами
МонАТ к ГА и гликопротеину F, рекомендовано использовать для определения патогенности
и биологической характеристики штаммов, циркулирующих в стадах вакцинированных и
невакцинированных птиц. Они могут быть использованы для идентификации полевых изо­лятов,
АГ-родственных шт. La Sota и В1, быстрой дифференциации этих
вакцинных штам­мов от вирулентных полевых изолятов.Метод картирования олигонуклеотидов. Этим методом исследован биохимический
состав нескольких штаммов вируса НБ, выделенных в штатах Калифорния, Техас и
Флори­да, это позволило легко дифференцировать штаммы друг от друга. Часть
штаммов оказа­лись идентичными. Считают, что метод олигонуклеотидного
картирования может быть эф­фективно использован с целью оценки эпизоотической
ситуации.Определение вирулентности выделенного
вируса. Помимо серологической
иденти­фикации часто возникает необходимость определения вирулентности
выделенного изолята. Это важно, когда возникает подозрение, что выделенный
возбудитель является штаммом, применяемым для массовой вакцинации. Степень
вирулентности можно определить следующими методами.Метод Хенсона -
определение индекса внутримозговой вирулентности. Исследуемым материалом в
разведении 1:10 заражают интрацеребрально в дозе по 0,05 мл 10 1-дн цып­лят,
полученных от невакцинированных против НБ кур. Время наблюдения 8 дн. Все по­гибшие
цыплята считаются специфическими; их сумму умножают на коэффициент 2. Все
цыплята, проявившие клинические признаки, тоже считаются специфическими; их
сумму умножают на коэффициент 1. Индекс интрацеребральной патогенности
вычисляют путем деления суммы балов на 80 (число наблюдений за 10 цыплятами в
течение 8 дн). Для лентогенных штаммов индекс до 0,2, для велогенных штаммов -
больше 1,5. Недостатком данной методики является - постоянный период наблюдения
- 8 дн.Метод
определения среднего времени гибели 10-дн. эмбрионов, вызванный минималь­ный
летальной дозой (СВГ/МЛД). Для этого готовят серию 10-кратных разведений иссле­дуемого
вируса от 10 -1 до 10-10, пять из них (10-1, 10 -7, 10 8, 10 9, 10 -10
используют для зара­жения 10-дн КЭ в аллантоисную полость в объёме по 0,1 мл.
Каждым из этих разведении инокулируют по 10 КЭ: по 5 заражают в 8ч. утра и в 16ч.
(в общем заражают 50 эмбрио­нов) и инкубируют их при 37°С. Наблюдают за ними 2
раза в день через 8 ч в течение 120 ч. Час гибели каждого погибшего эмбриона
регистрируют. Минимальной летальной дозой считают самое большое разведение
вируса, вызывающее гибель всех инокулированных эм­брионов. Среднее время гибели
находят путем деления суммы часов гибели всех эмбрионов, вызванной минимальной
летальной дозой, на число эмбрионов: среднее время гибели до 60 ч - велогенные
штаммы; среднее время гибели от 61 до 90 ч - мезогенные штаммы; среднее время
гибели от 90 и больше 100 ч – лентогенные штаммы. Однако методы эти
дорогостоящие и требуют много времени – необходимо затратить по меньшей мере 7дн.
для того, чтобы дифференцировать дикие штаммы от вакцинных.РСК. Быстрый и дешевый способ дифференциации штаммов. Диагноз
ставят в течение 3дн. после получения проб. Самое слабое связывание комплемента
вызывают велогенные дикие штаммы, самое сильное – лентогенные (например La Sota), в границах между сильны­ми и слабыми -
мезогенные. Кроме того, вирулентные штаммы менее антигенны, чем вак­цинные, в
отношении индукции синтеза КСА у морских свинок. Самую отчетливую диффе­ренциацию
дает сыворотка морских свинок, иммунизированных штаммом Хитчнера.Биопроба.   Начиная с 1972 г. в США, а затем и в других
странах были выделены штаммы с очень высокой вирулентностью. Их называют штаммами
WND (висцеро-тропные штаммы НБ). Для идентификации проводится биопроба на
восприимчивых цыпля­тах в возрасте не менее 6 нед. Цыплят заражают в клоаку. Несколько
особей заражают в глаз, внося туда каплю вируса. За птицами наблюдают10 дн.
Если в течение этого периода ни один цыпленок не погибает, считают, что штамм
не относится к WND. Если же птицы заболеют и погибнут в течение 10 дн., производят
вскрытие. В США принята следующая оценка интенсивности изменений (в баллах):
точные кровоизлияния или некротические из­менения в трахее - 25; точечные
кровоизлияния или некротические изменения в трахее  и сопутствующая им отечность трахеи и
в области входа в грудную  клетку
- 100; точечные кровоизлияния или некротические изменения в зобе - 100; некроз
и изъязвление желез сле­пой кишки и пейеровых бляшек - 100; точечные кровоизлияния
или некротические измене­ния слизистой оболочки клоаки - 10; воспаление брюшины
в области яичника - 10; точечные кровоизлияния в других местах - 10.
Диагностика VVND считается обоснованной, если об­щее число баллов достигает 150
или более.Серодиагностика и ретроспективная
диагностика. Критерием,
позволяющим судить о персистенции вирулентного вируса в стаде, являют­ся титры
AT в сыворотке крови птиц. Исследования проводят только с парными сыворотками,
полученными от одних и тех же птиц (или на одной и той же группе птиц). Первую
про­бу берут перед вакцинацией (или вначале болезни), вторую - на 15-20-й день,
последующие - в любое время (обычно 1 раз в месяц).РТГА. Реакцию ставят с 4 ГАЕ в макро- и микровариантах по общепринятой
методике. Результаты считают положительными, если разница в титрах 1-й и 2-й
сывороток составля­ет не менее 3-х разведении. Повышение числа положительно
реагирующих в РТГА между двумя исследованиями свидетельствует о распространении
инфекции в стаде. Постинфекци­онные AT обычно бывают в титре 10lg и более и
устанавливаются в течение продолжи­тельного времени, что указывает на
проходящую или прошедшую инфекцию. Обнаружение в стаде птицы анти-ГА в разведении
сыворотки крови 1:1024 - 1:2048 через 12-25 да после применения живых
вирусвакцин не является сигналом о неблагополучии его в отношении НБ, наоборот,
это свидетельствует о высокой реакции птицы на вакцину. Но если через 4-5 мес.
после вакцинации в стаде будут обнаружены титры AT 1:2048 или неровные титры,
т.е., когда у части проб крови (10-15%) их нет или они не превышают 1 2 - 1.4,
а в другой части (14-20%) составляют 1:1024 - 1:2048 и выше, то стадо надо считать
имевшим контакт с ви­рулентным вирусом.       Для определения активности
эпизоотического процесса птиц через 2 нед обследуют по­вторно. Обнаружение
высоких титров AT (1:4096 и выше) свидетельствует об обострении эпизоотической
ситуации. Для серологического контроля из каждого птичника берут по 25 проб
крови. Кратность исследований определяется эпизоотической ситуацией. AT
обнаруживаются не только в сыворотке крови. Большое количество их содержится, например,
в желтке яиц иммунизированных птиц. Этим путем происходит передача пассив­ной
резистентности потомству. Обнаружение AT в желтке яиц, полученных от вакциниро­ванных
кур, по мнению ряда авторов, более достоверно для определения состояния рези­стентности
поголовья птиц. Готовят экстракт из желтка: в пробирку наливают 1,5мл. яичного
желтка и 6мл. физиологического р-ра и тщательно перемешивают; добавляют 2мл.
дихлорэтилена и 1 мл эфира. Содержимое тщательно смешивают встряхиванием.
Оставля­ют смесь при 37°С до следующего дня, после чего центрифугируют в
течение 10 мин при 1,000 мин -1. Фракция дихлорэтилена находится внизу на дне
пробирки, над ней расположе­на полоса жира. Слегка мутную надосадочную жидкость
(она соответствует разведению 1.5 желтка яиц) отсасывают пипеткой и используют
в РТГА. Более простой метод заключается в следующем: желток отделяют от белка и
1 мл. его разводят 2 мл. фосфатного буфера с рН 7,2. Полученную смесь
гомогенизируют, затем центрифугируют 15 мин. при 1,000 мин. -1. Для РТГА берут
надосадочную жидкость между самым верхним слоем и осевшими частицами желтка.
Титры AT в желтке соответствуют содержанию их в сыворотке крови кур. Считают,
что для определения иммунного статуса стада кур к НБ значительно проще
исследовать AT в яичных желтках, чем в сыворотке крови. Такой подход
экономичен, исключает стрессы и опасность распространения болезни при взятии
крови. Исследуя желток, можно определить время первичной иммунизации цыплят,
выведен­ных из анализируемой партии яиц. Титр пассивных AT в постнатальный
период за 4,5 дня снижается на 1 log 2. Так,при исходном титре AT 7 log к 18
дню он уменьшается до 3 log 2, и до 5 log 2 к 9 дню. Надежный иммунный ответ
будет получен у 80-100% птиц при вакцина­ции цыплят в указанном возрасте per
os, интраназально или аэрозольно. Результаты иссле­дования желтка и парных
сывороток кур позволяют судить об уровне сероконверсии и по нему определять
напряженность поствакцинального иммунитета. Четырехкратное и более увеличение
анти-ГА свидетельствует о циркуляции эпизоотического вируса. Аналогичное
заключение делают по возрастанию индекса нейтрализации в 50-100 раз по
сравнению с первоначальными данными.Ставить диагноз
по сероконверсии при внедрении полевого вируса в стадо иммунной птицы трудно
без выделения вируса и определения его вирулентности на цыплятах. Можно только
предполагать, что птица имела контакт с полевым штаммом.РРГ. Эта реакция (РРГ) получила широкое применение и высокую оценку
при многих парамиксовирусных инфекциях. В опытах с вирусом НБ показаны линейная
зависимость диаметра зоны гемолиза от концентрации AT и полная корреляция результатов
РРГ и РТГА. Так, при титрах в РТГА 1:16-1:32 диаметр зоны гемолиза составлял 6-7 мм,а при 1:64 и 1.1024 -
7,5±0,3 и 9,5±0,5 мм.
соответственно. При повторных исследованиях одних и тех же сывороток
расхождение показателей не превышало 0,5
мм.ELISA. Многочисленные данные зарубежных исследователей свидетельствуют
о высо­кой чувствительности, специфичности этого метода и корреляции между
титрами AT в РТГА и ELISA. Разработан набор для скрининга сыворотки птиц на
присутствие AT к НБ Титры в ELISA выше, чем в РТГА и показывают высокую степень
корреляции. При исследовании сывороток крови от вакцинированных птиц титр AT в
ELISA был в 2-4 выше, чем в РТГА. AT к вирусу в ELISAи РТГА выявляются в 98, и
91,7% соответст­венно, коэффициент корреляции равен 0;85. Однако ELISA
отличается большей чувст­вительностью. На основании реактивности с монАТ штаммы
вируса НБ разбиты на 5 групп. Для постановки реакций ELISA и РЗГА при
обнаружении AT к вирусу НБ целесооб­разно использовать хлороформный экстракт.Дифференциальная диагностика. НБ следует дифференцировать от ИБП,
гриппа, ПМВ-2, ИЛТ и микоплазмоза птиц. Для лабораторной диагностики гриппа
птиц, ИБ и НБ используют диагностикумы биофабричного производства. Дифференциация
вирусов гриппа, насчитывающих 14 подтипов, и парамиксовирусов, включающих 9
серотипов, возможна только в лаборатории. Особое внимание следует сосредоточить
на эпизоотологическом мо­ниторинге при этих болезнях, исследовании парных
сывороток и периодическом лаборатор­ном анализе патматериала.Иммунитет. Естественно переболевшая или
вакцинированная птица приобретает иммунитет, про­должительность и напряженность
которого зависит от возраста птицы, биологических свойств вируса и метода
введения его в организм.Для
специфической профилактики применяют инактивированные и живые вакцины.
Количество первых последнее время значительно сокращалось. Однако односторонняя
ори­ентация на живые вакцины разной степени аттенуации и в ряде случаев
нежелательные по­следствия их применения вынудили исследователей и практических
специалистов вновь вернуться к инактивированным препаратам, правда, более современным.Применение живых вакцин. Ассортимент живых вакцин, применяемых в
настоящее время весьма широк: Н, В, F, FR, Комаров, Roakin, Ла Сота,
Банковский, Муктесвар, Миннесот, Бургас, Нью-Джерси, Нью-Йорк, Накарелла,
К,ГАМ, V4 и др. Среди вакцин­ных лентогенных штаммов вируса НБ известны - В,
NDP,LZ58 и Clone 30, Ulster 2C.В 1989 г.в Австралии выделен шт. N4,
характеризующийся полной авирулентностью для птицы и активным распространением
его среди птиц (высокой контагиозностью). Вирус вызывает иммунитет при введении
интраокулярно, внутримышечно и аэрозольно. Он персистирует в организме привитой
птицы до 2 лет. У подсаженной не привитой птицы к вакцинированной в течение 80дн.
обнаруживались AT. Несмотря на низкие титры (ниже 3 Iog2 ), привитая птица
обладала устойчивостью к заражению вирулентным вирусом, что свидетельствует о
развитии местного секреторного или клеточно-опосредованного иммунитета
безвысоких титров гуморальных AT.Пероральная
вакцинация шт. У4 (Австрия) стимулирует лимфоидные ткани кишечного тракта, что
индуцирует секреторные иммуноглобулины и обеспечивает защиту даже при низком
уровне циркуляторных гуморальных AT. Шт.V4, заданный с питьевой водой или
кормом, после вакцинации выделяется в окружающую среду. По мнению авторов, пероральная
вакцинация этим штаммом может разрешить ряд проблем профилактики НБ в не­больших
фермерских хозяйствах. Пылевидная вакцина из шт. La-Sota разработана во
ВНИИВВиМ. В основе технологии изготовления использован метод сушки смеси
вируссодержащего материала с наполните­лем. Вакцина обеспечивает высокий
иммунологический эффект и практически не обладает реактогенностью в широком
диапазоне доз, имеет выраженную иммуногенность для цыплят 14-16 нед возраста в
благополучном и стационарно неблагополучном стаде птиц.В ВГНКИ ветпрепаратов
проведены исследования по совершенствованию методов кон­троля иммуногенности
вакцин против НБ. Установленный минимальный защитный титр ан-ти-ГА 3 Iog2 и
более, давал вполне объективную информацию о иммуногенности вакцины. Для
исключения погрешностей в методику была включена референс-вакцина НБ, позво­ляющая
правильно интерпретировать получаемые результаты и более дифференцировано
подходить к оценке этого показателя у серийно производимого препарата.
Референс-серии готовят во ВГНКИ, контролируют на соответствие заложенным в ТУ
параметрам и постав­ляют на биопредприятия. Новая методика предусматривает
10-кратный запас иммуногенно­сти и обязательное соответствие параметрам
референс-серий не менее чем на 80%. Экспе­риментально определены иммунизирующие
дозы (НМД), обеспечивающие абсолютную за­щиту птицы от 1000 ЛД50 вирулентного
вируса (ИМД90), равные для шт. La Sota/ 6,7 lg ЭИД50, для шт.
Бор/74 ВГНКИ - 6 lg ЭИД50 при интраназальном применениии 7,7 и 7,0 lg ЭИД50
соответственно при энтеральном применении. Они оказались значительно выше, чем
в случаях применения серий вакцин с минимально допустимой по ТУ активностью
(8,0 lg ЭИД5о /см3). В связи с этим минимально допустимая инфекционная
активность препара­тов увеличена до 9 lg ЭИД50 /см3.В СНГ широко применяют
сухие вирусвакцины из шт. Н, Bl, La Sota, Бор/74/ВГНКИ. В профилактике
НБ важна разработка оптимальной схемы иммунизации птицы. Наиболее подходящий
возраст для первой вакцинации - 10-14-й день, а для ревакцинации - 5-6 нед.
Лучшие результаты получены при аэрозольной вакцинации в 10-дн., 5- и8 –нед.
возрасте. У индюшат осложнения после применения живой вакцины против НБ в2-3
нед. возрасте свя­зывают с подавлением вакцинным вирусом фагоцитарнойа ктивности
альвеолярных макро­фагов. Во избежание этого предложена более рациональная
схема иммунизации индюшат. В первый день жизни им вводят подкожно инактивированную
вакцину в дозе 0,1 мл, а через 2 нед. аэрозольно вакцинируют живой вакциной из
шт. В1. Такая вакцинация обеспечивает длительный иммунитет. Высокий уровень
поствакцинального иммунитета у матерей не пре­пятствовал иммунизации суточных
индюшат инактивированной вакциной. В неблаго­получных товарных хозяйствах
рекомендуют прививать индеек аэрозольно с интервалом 5 нед. в течение всего
производственного периода. Преимущество гранулированных форм вакцин из шт. У 4 u
Roakin в их более высокой термостабильности; их можно транспортировать без
рефрижератора и смешивать с любым обычным кормом.Активность
клеточного иммунитета у цыплят, вакцинированных шт. V4 вируса НБ, оп­ределяли с
помощью теста ингибиции миграции лейкоцитов (ИМЛ).Исследовали роль
защитных реакций слизистых оболочек в создании поствакцинально­го иммунитета.
Цыплят вакцинировали 2-кратно с 2-недельным интервалом интраназально,
интраокулярно и введением вакцины в зоб. Каждый цыпленок получал дозу 7,8 lg
ЭИД50 шт. V4. Через неделю в сыворотке и слезной жидкости цыплят,
вакцинированных всеми способами, обнаруживали повышение уровня AT. Оральная
вакцинация inr.V4 индуцирует у цыплят не только гуморальные иммунные реакции,
но и реакции иммунокомпетентных элементов слизистых оболочек. Показана высокая
интерферирующая активность ПМВ-2, что необходимо учитывать при изготовлении
эмбриональной вакцины против НБ .Получена живая
вакцина из мутанта шт. Hitchner В1 путем клонирования методом бля­шек серийными
пассажами при температуре 28-30°С. Н.А. Лагуткин и соавт. реко­мендуют
выпускать вакцины из шт. Bl, La Sota и Бор/74 ВГНКИ с активностью не ниже 9
lg ЭИД50/мл. и с титром в РГА не ниже 1:128. Доза при интраназальном
(окулярном) введе­нии должна быть 2-4 млн. ЭИД50/мл, а при пероральном
применении 10-20 млн. ЭИД50/мл с выпаиванием 2 дня подряд. Э.Ф. Токарик и
соавт. рекомендовали свой способ профилактики НБ, суть которого со­стоит в том,
что цыплят в суточном возрасте иммунизируют вакциной из шт. La-Sota вдозе 20-40
ЭИД5о/на голову. После вакцинации цыплятам с кормом вводили пробиотик
Авилакт-1К в суточной дозе 0,5 - 1,5% от массы корма 2-мя циклами по 7-15 дн. с
перерывом 15-12 дн. Использование пробиотика Авилакт-lK повышал антигенность
вируса La Sota, усиливал иммунный ответ
и устраняет нежелательное действие материнских AT при иммунизации су­точных
цыплят. Экспериментальное обоснование эффективной дозы вакцины и перевод её
дозировки с объёмных единиц в количественные (ЭИД50) проведено во ВНИТИБП. Для
цыплят 15-20-сут возраста эффективная защитная доза (защита 80-100%) при
интраназальной вакцинации составляет 103-106 ЭИД50 при титрах анти-ГА
1:8-1:512. Для цыплят 5-сут. возраста, имевших материнские AT, эффективная доза
составляет 10б,3  ЭИД50.В
опытах с использованием для заражения цыплят как 100 ЛД50, так и 2-106 ЛД50 вирулентного
штамма вируса НБ показано, что применение вакцины в дозах 1-106-5-106 ЭИД5о
обеспечивало защиту как 5, так и 20-сут. цыплят. Динамика накопления анти-ГА и
устойчивости птицы следующая: на 4-й день титр анти-ГА составлял 1:8-1:16,
степень за­щиты - 70%; на 6-й день - титр - 1:32, защита -90%; на 8-й день титр
- 1:32-1:64, защита 100%; на 14-й день титр - 1:64-1:512,защита - 100%. Максимальное
накопление анти-ГА наблюдалось через 30 дн., к 120-му дню титр их снижался до
1:8-1:4. Однако степень защи­ты через 3 мес. составляла 92-100%, через 5 мес. -
70-85%.Пассивный
иммунитет у цыплят имеет прямое отношение к вирусоносительству и вирусовыделению.
Так, при заражении пассивно иммунных цыплят патогенным вирусом 68% из них не
проявляли признаков болезни в течение 80 дн. наблюдения, но выделяли вирус в те­чение
45дн., а вирусоносительство наблюдалось 54 дня. Этот факт имеет большое
эпизоотологическое значение при проведении мероприятий по санации хозяйств от
НБ.Во ВНИИВВиМ
разработана новая технология ассоциированной вирус-вакцины против ИЛТ и НБ. Она
позволяет получать вакцины для аэрогенного применения с активностью 7 lg ЭИД50
/см3 по вирусу ИЛТ и 7,2-7,7 lg ЭИД50 /см3по НБ; для интраназального и орально­го
применения - по ИЛТ не ниже 7,0 lgЭИД50 /см3, по НБ не ниже 9,0 lg ЭИД50 /см3.
После двукратной вакцинации в оптимальных дозах иммунитет формируется у 85-100%
птиц и со­храняется около 6мес.На основе
мезогенного шт. ГАМ-61[А(в)ВН], выделенного из эпизоотического и затем
аттенуированного в культуре клеток почек теленка и КЭ, разработана новая
вакцина. После испытания в лабораторных и камеральных условиях установлено, что
штамм обладает вы­сокой иммуногенностью: обеспечивает защиту 97-100% птицы,
привитой различными спо­собами; безвреден в 10-и 100-кратной дозе для цыплят
моложе 60-дн возраста, кроме того, его можно использовать в хозяйствах с острой
эпизоотической ситуацией Иммунитет на­ступает через 72-96ч. Высокая
эффективность вакцины подтверждена на 8-миллионном по­головье птиц в стационарно
неблагополучных хозяйствах Ставропольского и Краснодарско­го краев. Авто­рами
изучен механизм формирования ранней невосприимчивости экспериментально инфи­цированных
цыплят, привитых вакциной из шт. ГАМ-61. Результаты опытов показали, что в
механизме формирования ранней невосприимчиво­сти к вирусу НБ ведущая роль
принадлежит факторам клеточного иммунитета. Защитное влияние гуморальных AT
проявляется значительно позже, и в течение первых 3-5сут. не в полной мере
отражает истинный иммунологический статус организма.Аэрозольная
вакцинация эффективна и безопасна только в стадах, благополучных по
респираторным заболеваниям вирусной или бактериальной природы. В противном
случае она провоцирует проявление ИЛТ, микоплазмоза и других болезнейПрименение
инактивированных вакцин. Инактивированные вакцины обычно при­меняют в сочетании
с живыми. Хороший защитный эффект получали, если однодневных цыплят прививали
живой вакциной, а через 3 и 8 нед. -инактивированной.Предложено
одновременное применение живых и убитых вирусов НБ для вакцинации суточных
цыплят с низким уровнем материнских AT. В качестве живой вакцины использо­вали
лентогенный шт. La Sota, а в качестве инактивированной
- формолвакцину, содержа­щую неионизированный детергент твин-80 в
виде водно-масляной эмульсии с низким со­держанием минерального масла. Живую
вакцину вводили в глазнично-носовую область, а инактивированную –подкожно.
Титры специфических AT у цыплят, привитых живой вакци­ной медленно возрастали в
период с 28-го по 73-й день, в то время как уровень AT у цыплят второй группы, привитых
одновременно живой и инактивированной вакцинами, был по­стоянен. Разовая
одновременная вакцинация в инкубационном зале обеспечивает стойкий иммунитет на
весь период откорма бройлеров и позволяет исключить ревакцинацию. Инактивированные
вакцины готовят из вируса, размноженного в КЭ. Активность одной дозы вакцины
обычно не менее 8 lg ЭИД50/см3 инактивированного вируса. Концентрация его
оказывает существенное влияние на титр сывороточных AT. В качестве инактивантов
вируса НБ используют формальдегид, р-пропиолактон, этиленимин. Хорошими
адъювантными свойствами обладал авридин. Вакцина с авридином не вызывала
реакций на месте введения. Помимо того, инактивированную эмульгированную
вакцину типа "вода в масле" готовили с помощью р-пропиолактона и в
качестве эмульгатора использовали арлацел и твин-80. Кур прививали в возрасте 8
нед., когда полностью исчезали материнские AT. Вакцину вводят 2-3 раза с 4-нед.
интервалом. Подкожное введение оказалось более эффек­тивным, чем
внутримышечное. Максимальные титры сывороточных анти-ГА составляли 1:1280-1:2560.
AT сохранялись в течение 30 или 35 нед. соответственно после 2- и 3-кратной вакцинации.
Напряженный иммунитет сохранялся свыше года. При хранении вакцины с адъювантом
при 4°С более 18 мес. ее эффективность не снижалась. При однократной вакци­нации
кур в возрасте 16 нед. титр AT начинал снижаться через 12 нед.Вакцина против
НБ оказалась эффективной против парамиксовируса птиц типа 3, вызы­вающего
снижение продуктивности у индеек. Хороший иммунитет создавала вакцина из го­мологичного
вируса, вводимая двукратно. Вакцина из парамиксовируса-3 защищала птицу от
вируса НБ, но не наоборот, т.е. имеет место одностороннее АГ родство.Оценка поствакцинального иммунитета. Эффективность вакцинации зависит от
им-муногенности вакцинного штамма, наличия пассивного иммунитета, возраста
цыплят, дозы и метода введения вакцины, соблюдения сроков между прививками,
техники вакцинации, очередности применения более или менее аттенуированных
штаммов, физиологического со­стояния организма птицы и пр. Поэтому схемы и
методы вакцинации должны разрабаты­ваться для конкретных хозяйств исходя из
эпизоотической ситуации. При проведении профилактической вакцинации необходимо
добиваться создания 100%-ного напряженного им­мунитета у птицы всех возрастных
групп. Этого можно достигнуть в том случае, если в хо­зяйстве хорошо
организована система контроля поствакцинального иммунитета. Эффективность
вакцинации против НБ можно оценивать двумя способами: биопробой и определением
титра анти-ГА. Во втором способе исследуют сыворотки в РГГА. Для этого через
12-15 дн. после вакцинации берут кровь от 25 цыплят из 5-6 точек каждого птичника.
Напряженность иммунитета проверяют также за несколько дней перед следующей
вакцина­цией. В угрожаемых и бывших неблагополучных хозяйствах напряженность
иммунитета у взрослой птицы проверяют через каждые 60 дн. Вакцинацию считают
эффективной, если в более 80% проб исследуемой сыворотки крови цыплят в
возрасте до 30 дн. AT выявляли в разведениях 1:8 и выше, у молодняка до 20дн. -
1:16и выше, у взрослых кур - 1:64 и выше, меньшие титры AT служат показателем
необходимости ревакцинации птицы. Анти-ГА появляются на7-10-й день после
вакцинации; титр их достигает максимально­го уровня 1:256-1:2048 к 25-30-му
дню. Через 60 дн. после вакцинации титры AT снижаются (1:8-1:256), а через 5-6
мес. остаются только их следы. Через 2 мес. После вакцинации у 99,5-100% исследованных
желтков яиц титры AT выше 1:8. Выявлена четкая корреляция титров в сыворотке
крови и пульпе пера в отношении материнских AT, так и в отношении активно
выработанных AT на 60-96-й дн. После вакцинации. Если после ревакцинации
уровень сероконверсии равен 1,2 и более, то иммунизация проведена качественно и
своевременно, если он ниже 1,2 или отрицательный, то прививка птицы была
сделана без учета титра пассивных или высокого титра активных AT. Случаи низкой
сероконверсии или слабой напряженности иммунитета после первичной вакцинации
отмечают при недостаточном АГ-раздражении (заниженной прививной дозе),
иммунизации птицы с высоким титромAT, сближении срока ревакцинации и частых АГ
раздражении (многократные вакцинации за короткий промежуток времени), нарушении
гигиены кормле­ния и содержания, острых инфекционных болезнях или влиянии
других иммунодепрессивных факторов. Высокий уровень AT и сохранение его в
течение года и более после однократной имму­низации вирусвакцинами из штаммов
Bl, La Sota, F, Br или инактивированной
ГОА-вакциной свидетельствует о циркуляции среди птиц полевоговируса НБ.Необходимо
обратить внимание на недостаточное АГ раздражение при оральном при­менении
вакцины. Однократное выпаивание препарата в рекомендуемых дозах индуцирует
выработку специфических AT только у 20-70% птиц, а применение его 2 дня подряд,
как правило, обеспечивает устойчивость к вирулентному вирусу у 80-100%.Генно-инженерные вакцины. Сконструирован рекомбинант вируса оспы
птиц, экспрессирующий ГА-нейраминидазный протеин вируса НБ. Рекомбинант обладал
выражен­ными защитными свойствами - птица, иммунизированная внутримышечно,
после одной прививки через 28 сут выдерживала заражение вирулентным вирусом.
Для получения рекомбинантной живой вакцины ген слияния Авируса НБ клонировали
под контролем про­мотора Р75 в вакцинный штамм ВЧП по CoitySpel. Был отобран
один рекомбинант fp EFF2, у которого ген F был выявлен в концевых повторах
геномной ДНК. Считается что данная векторная система может быть использована
для получения генно-инженерной мультивалентной вакцины, экспрессирующей гены
таких патогенных для птиц вирусов как ИБ, БМ, ИЛТ, ИББ.