Инфекционный ларинготрахеит птиц
Инфекционный ларинготрахеит птиц (ИЛТ) Infectiose Laryngotracheitis des Huhnes (нем.),Infections laryngotracheitis(aнг.), Laryngotracheite infectieuse (франц.) - это вирусная контагиозаная респираторная болезнь поражающая кур, индеек, фазанов Впервые описан в 1925 г Мей и Титслер под названием инфекционный бронхит С 1931г ее стали именовать инфекционным ларинготрахеитом. Регистрируется во всех странах мира, где развито промышленное птицеводство.
Сведения о возбудителе. Вирус впервые выделил Бичь в 1930 г в США
Морфология и химический состав. Геном вируса ИЛТ имеет длину 155 тыс пни состоит из длинной уникальной последовательности 1Д (120 тыс пн) и короткой уникальной последовательности Us (17 тыс п н ). Гликопротеины вируса ИЛТ были выделены из экстрактов вирусинфицированных клеток и очищены с помощью лектин-аффинной хроматографии Гликопротеины предохраняли 83 % птиц от заражения их патогенным вирусом. Гликопротеин В (gB) является первым структурным белком вируса ИЛТ птиц Клонирован, секвенирован ген этого белка.
Устойчивость. Вирус чувствителен к липолитическим агентам,теплу и различным де-зинфектантам Он длительно сохраняет свою активность влиофилизированном состоянии или при - 20-60°С Температура 55°С разрушает вирус в течение 10-15 мин, а 38°С - за 48 ч В вируссодержащей трахеальной слизи больного цыпленка вирус разрушается в течение 44 ч при температуре 37°С, а в ХАО при 25°С в течение 5 ч В патологическом материале (трахее от больных кур)при температуре - 8-10°С он сохранялся более 370 дн В замороженных тушках больных и вынуждено убитых кур, хранившихся при температуре - 10, 18, 28°С ,вирус оставался активным более 19 мес, на поверхности скорлупы в условиях термостатаин активируется через 12 ч, а в зараженных птичниках сохраняется не более 9 дн Полностью инактивируется в 1 %-ном растворе креола в течение 30 с %
АГ вариабельность и родство. Все птичьи герпесвирусы на основании перекрестной РН сгруппированы в 11 разных групп. Штаммы вируса ИЛТ различаются по вирулентности для птиц и КЭ, тропизму, скорости выделения из клеток в тканевой культуре, устойчивости при хранении, авидности,молекулярно-структурными особенностями Иммунологических различий среди штаммов вируса ларинготрахеита не обнаружено, хотя некоторые отклонения в способности нейтрализоваться гипериммунными сыворотками описаны у штаммов различной вирулентности.
Локализация вируса. Вирус обнаруживают главным образом вдыхательных путях, в меньшем количестве в печени и селезенке. При интратрахеальном заражении 30 дневных цыплят его выделяли из трахеи и носовых ходов 7 дн, при ректальном заражении находили в фабрициевой сумке и трахее в течение 3 дн. У птиц-реконвалесцентов установлено длительное вирусоносительство. Из трахеи переболевших птиц вирус выделяли 2 дня. Послеострой фазы ИЛТ может наступить латентный период с сохранением генетического материала вируса в ДНК клеток ганглия тройничного нерва. При различных воздействиях может произойти реактивация инфекции с выделением вируса во внешнюю среду.
АГ активность. ВНА у зараженных кур появляются со 2-3 недели после заражения, титр их достигает максимума к 5-му дню и сохраняется до 8-21 месяцев.
Экспериментальная инфекция. Заразить восприимчивую птицу легко путем аппликации вируссодержащего материала на слизистую оболочку гортани, трахеи, глаз, носа, подглазничного синуса и клоаки. На 6-12 дн у зараженных цыплят развиваются типичные симптомы болезни. На 3-10 дн после внутри трахеальной инокуляции вируса у кур-несушек отмечаются признаки умеренного респираторного заболевания. На 4-й дн в ткани трахеи и носовой полости обнаруживается вирус. В период между 19 и 59 дн после заражения с помощью ЦПР периодически выявляется вирус. Ганглии тройничного нерва являются основным местом локализации вируса. У экспериментально зараженных СПФ-цыплят вакцинным шт. SA-2 вируса ИЛТ вирусный АГ в трахеальных смывах определялся до 7-го дн после заражения, a AT против вируса в трахеальных смывах с 5-го дн после заражения. Иммуноглобулины класса А появлялись на 6-й день после заражения, а ВНА - только на 14 день. Вирус вызывал заболевания у индеек в возрасте 3-4 нед и 2-10 мес. Больные индейки могут быть источником заражения кур. Данные о восприимчивости голубей к вирусу противоречивы Павлины и фазаны оказались чувствительными к вирусу, причем чувствительность фазанов была выше Кролики, морские свинки и белые крысы резистентны.
Вирусовыделение. В экспериментальных условиях инфицированные птицы начинают экскретировать вирус через 8 дней после заражения Прединфекционный период может длиться 2 дня, а выделение вируса наблюдалось в течение 6 дн. Клинические признаки у зараженной птицы обычно появляются на 6 дн. В организме переболевших птиц вирус ИЛТ, как и многие другие герпесвирусы, может находиться в латентной форме. Полевые штаммы ,как и вакцинные обладают свойством персистировать в нервной системе. Вакцинный вирус легко передается горизонтально. Поэтому при применении вакцины лучше иммунизировать всех цыплят птицефермы.
Культивирование. Вирус культивируется на ХАО эмбрионов кур,уток, индеек, некоторых первичных и перевиваемых культурах клеток, неразвивается в эмбрионах голубей и морских птиц. На ХАО образуются фокусные поражения 2 типов крупноузелковые с непрозрачной белой периферией инекротическим центром и мелкоузелковые - без некроза. Узелковые поражения появляются на всей поверхности ХАО, а очаговые только на месте инокуляциивируса. В зараженных клетках ХАО образуются внутриядерные включения, а иногда гигантские клетки. В культурах линий СПЭВ, FJ, клеток фибробластов куриных эмбрионов, почки цыплят, утят, эмбрионов свиньи, новорожденных крольчат вирус вызывает к 3-4 дн ЦПИ, характеризующиеся округлением и зернистостью клеток, лизисом их с последующим отторжением. В клетках СПЭВ формируются цитоплазматические включения и образуются многоядерные клетки. Внутриклеточные включения обнаруживаются через 12 ч и к 30-36 ч после заражения достигают наивысшей концентрации. В инфицированных культурах клеток вирус вызывает образование бляшек.
ГА свойства. Вирус, репродуцированный в КЭ, не обладает ГА активностью Она проявляется иногда в случае культивирования вируса в первичной культуре почки цыплят.
Эпизоотологическая характеристика. Источники и пути передачи инфекции. Источник инфекции -больная и переболевшая ИЛТ птица, которая длительное время (свыше 2 лет)остается вирусоносителем. Вирус от больных птиц можно выделить в течение 7 дн после появления симптомов болезни, после чего отдельные переболевшие птицы остаются вирусоносителями и периодически выделяют вирус, не обязательно при этом с переходом болезни в клиническую форму. Инфицирование может происходить и половым путем. Возможна передача вируса через зараженную скорлупу яйца. В условиях инкубатора вирус сохраняет инфекционность до 96 часов. После обработки яиц парами формальдегида он погибает через 40 минут. После острой фазы инфекции может наступить латентный период с сохранением генетического материала вируса в ДНК клеток ганглия тройничного нерва. При различных воздействиях может произойти реактивация инфекции с выделением вируса во внешнюю среду. Благоприятным фактором в плане искоренения инфекции в птицеводческих хозяйствах являются высокая степень видоспецифичности вируса, необходимость тесного контакта кур для распространения инфекции, быстрая инактивация вируса вне организма птиц,генетическая стабильность вируса, отсутствие размножения вируса в трахее при наличии местного специфического клеточно-опосредованного иммунитета.
Спектр патогенности в естественных условиях. В естественных условиях вирус поражает кур всех возрастов Фазаны и индейки также чувствительны к вирусу ИЛТ
Клинические признаки и патологоанатомические изменения.Инкубационный период колеблется от 2 до 30 дней. Длительность его зависит от вирулентности, дозы вируса, метода введения в организм и физиологического состояния птицы. Наиболее короткий инкубационный период , равный 40 ч , отмечен при интратрахеальном заражении. Болезнь протекает сверхостро, остро и хронически. Различают легкую и атипичную формы болезни, а по локализации поражений -ларинготрахеальную и конъюнктивальную формы. Первая обычно протекает остро и сопровождается кашлем, удушьем, хрипом при дыхании. Катаральное или фибринозное воспаление слизистых оболочек можно наблюдать в носовой полости иинфраорбитальных синусах Слизистая оболочка в этих случаях гиперемирована набухшая, иногда пронизана мелкими точечными кровоизлияниями. В ротовой полостина слизистой оболочке можно находить легко отделяемые налеты беловатого цвета локализующиеся у корня языка, в углах клюва, окружности неба и у входа в гортань и глотку В ряде случаев отмечают катаральный фарингит На вскрытии изменения находят главным образом в гортани и трахее. В просвете гортани обнаруживают казеозную пробку. После ее удаления слизистая оболочка гортанинеровная, красноватая, отечная, утолщенная. Конъюнктивальная форма чаще наблюдается у цыплят и характеризуется катаральным или фибринозным конъюнктивитом. Эта форма может протекать только с поражением конъюнктивы или в сочетании с ларинготрахеальной формой болезни У части птиц отмечают отек век,особенно нижнего У некоторых кур и цыплят развивается фибринозное воспаление конъюнктивы с отложением в конъюнктивальный мешок фибринозно-казеозных масс склеиванием век, помутнением роговицы, иногда с развитием панофтальмита. Изменения в легких при ИЛТ находят обычно у небольшого количества птиц. В некоторых случаях они ограничиваются только бронхами, в которых развивается катаральное, реже фибринозное воспаление, иногда в просвете бронхов обнаруживают сгустки крови или фибринозно-казеозные пробки.
Более характерные признаки ИЛТ отмечаются у цыплят-бройлеров в возрасте 4-7 нед и у кур-несушек в возрасте 18-76 нед. В ряде случае водно временно с бронхитом выявляют катаральную пневмонию в виде небольших сероватых уплотненных участков, иногда с мелкими очагами некроза желтоватого цвета Поражение воздухоносных мешков встречается сравнительно редко Однако при экспериментальном воспроизведении инфекции, особенно при интратрахеальном методе заражения, аэросаккулит часто находят у значительного количества птиц. Стенка воздухоносных мешков при очаговом или диффузном поражении утолщена,частично или полностью непрозрачные сосуды ее переполнены кровью. В полости воздухоносных мешков находят серозный пенистый экссудат со сгустками фибринаили зернами фибринозно-казеозных масс В эпителиальных клетках трахеи уже через 12ч после заражения находят внутриядерные включения типа А. При обычном окрашивании они представляются однородными, а при серебрении выявляются аргининофильные гранулы.
При ларинготрахеальной форме болезни характерные изменения отмечают в гортани и трахее. Слизистая оболочка этих органов гиперемирована, отечна, эрозирована, с кровоизлияниями, а просвет их часто бывает заполнен катаральным или катарально-геморрагическим экссудатом. В большинстве случаев в гортани находят фибринозно-казеозные массы, закупоривающие просвет. При некоторых энзоотиях обнаруживают катаральное воспаление слизистых оболочекносовой и ротовой полостей, а на корне и уздечке языка фибринозные наложения.У некоторых кур наблюдают увеличение селезенки, катаральное воспаление тонкого кишечника, фабрициевой сумки и клоаки. В бронхах и легких поражения встречаются редко, в виде катаральной бронхопневмонии. При конъюктивальной форме отмечают серозный или фибринозный конъюнктивит с отложением в конъюнктивальный мешокказеозных масс, помутнение роговицы и поражение глазного яблока.
Гистологические изменения. Соответствуют картине вскрытия. В гортани и трахее находят серозно-катаральное или фибринозно-геморрагическое воспаление слизистой оболочки. В начале болезни выявляют гиперемию сосудов, дистрофию покровного эпителия и отек слизистой оболочки, в более поздние сроки некроз и десквамация респираторного эпителия, инфильтрацию слизистой оболочки или мфоидно-гистиоцитарными элементами и пе-риваскуяярные кровоизлияния. В отдельных участках слизистая бывает некротизирована до хрящевого кольца. Вирус размножается в эпителиальных клетках слизистой оболочки гортани, трахеи,конъюнктивы, легких, воздухоносных мешков, клоаки и народу с воспалительной реакцией образует внутриядерные включения. Включения обнаруживают до наступления некроза эпителия между 1-5-м дн после заражения. Форма их округлая, овальная или продолговатая, количество в одре 1-4 , окружены светлым ободком. Описано спонтанное массовое некротическое поражение тимуса, фабрициевой сумки и селезенки у 40-дн цыплят-бройлеров с признаками анемии. При вскрытии обнаружено уменьшение размера тимуса и фабрициевой сумки, которые имели темно-желтый или коричневый цвет, отмечалась также диффузная аденоэктазия железистого желудка.При гистологическом исследовании наблюдали очаги фибрино-гнойного воспаления инекроза в тимусе, фабрициевой сумке и селезенке В гистиоцитах и лимфоцитах этих органов обнаружены одиночные крупные внутриядерные тельца-включения. С помощью трансмиссионной электронной микроскопии в набухших ядрах с периферическим расположением хроматина гистиоцитов тимуса зафиксировано наличие герпесвирусных частиц. При остром течении болезни вирус ИЛТ в 85-86% случаев обнаруживали в инфицированных клетках трахеи и гортани, в 80-88 % - в инфицированных клетках крупных бронхов и лишь в 60 - 62 % - в инфицированных клетках мелких бронхов и бронхиол. Вирус ИЛТ в 76-84 % случаев удается выделить из смывов носоглотки,гортани и трахеи. При подостром и хроническом течениях положительные результатыполучали при исследовании инфицированных клеток гортани и трахеи (96 %),бронхов и бронхиол (85 %), смывов носоглотки, гортани, трахеи (72-86 %), ЖКТ(до 60%) и печени (8-12%). Таким образом при хроническом течении болезни положительные результаты по выделению вируса ИЛТ выше, чем при его остром течении, исключая печень. Тем самым диагностическая надежность метода вирусовыделения при исследовании органов птиц с разной степенью выраженности патологических изменений составляет от 85 % (при остром течении) до 96% (приподостром и хроническом течении заболевания). Однако метод вирусовыделения,обладая высокой специфичностью имеет существенный недостаток - значительная продолжительность во времени (до 45-52 дн).
Патогенез. Вирус проникает в организм через конъюнктиву, носовую или ротовую полости и репродуцируется в эпителиальных клетках слизистой оболочки гортани и трахеи,вызывая серозно-катаральное воспаление и образование внутриядерных включений. Впораженных эпителиальных клетках происходит быстрое размножение ядер безделения цитоплазмы. Через 24 ч из мест поражения вирус поступает в кровеносную систему. На этой стадии заболевания обнаруживают дистрофию, некроз и десквамацию эпителия слизистой оболочки респираторного тракта, а в просвете трахеи слизистой экссудат с примесью крови. При дальнейшем течении болезни поражения слизистой гортани и трахеи усиливаются не только самим действием вируса, но и в результате происходящих в ней дистрофических изменений.Отмечают сужение просвета дыхательных путей, а часто и образование казеозных пробок, что приводит к полной их закупорке и птица погибает от асфиксии.
Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков болезни, и результатов лабораторных исследований. Часто болезнь протекает атипично, характерные признаки ее слабо выражены или их нет. В таких случаях решающее значение в диагностике приобретают лабораторные методы исследования.
Выделение вируса. Взятие и подготовка материала. Для вирусологического исследования от больных птиц берут экссудат из трахеи, отпавших или вынужденно убитых в начальной фазе болезни между 2-7 дн - слизистые оболочки гортани, трахеи, конъюнктивы, носовых ходов и кусочки легких. Материал замораживают и сохраняют при - 20°С и ниже. Для гистологических исследований материал помещают в 10%-ный раствор нейтрального формалина. Из патологического материала готовят суспензию 1 5 на растворе Хенкса или изотоническом растворе NaС1, центрифугируют при 1500-2000 мин 1 в течение 15мин, к надосадочной жидкости добавляют по 1000 ЕД пенициллина и 500 мкг стрептомицина в расчете на 1 мл выдерживают в течение 3-8 ч при 2-4°С. Затемиспользуют для инокуляции КЭ, культуры клеток или не иммунных к ИЛТ цыплят
Заражение КЭ. Для каждой пробы используют по 10 эмбрионов в9-12 да возраста. Заражают на ХАО Погибших в первые 24 ч после инокуляции эмбрионов не учитывают Оставшихся живых эмбрионов на 6-8-й дн убивают.Макроскопические изменения ХАО появляются через 2,5-3 сут и достигают максимума к 5-6 дн. Штаммы вируса ИЛТ вызывают мелкоузелковые и очаговые поражения ХАО. Узелковые поражения обнаруживаются по всей поверхности ХАО,очаговые - только на месте инокуляции вируса. Необходимо учитывать, что не все штаммы вызывают гибель куриных эмбрионов на 4-6- дн. Для выявления специфических поражений надо провести не менее 3 пассажей, используя ХАО, суспендированную в аллантоисной жидкости предыдущего пассажа.
Выделение вируса надо подтвердить обнаружением телец-включений Зейфрида, РН, РДП,биопробой, а также ИФ и ЭМ.
Заражение культур клеток. Наиболее пригодны в данном случае культуры клеток почек эмбриона и цыплят, в которых первые изменения наблюдаются иногда уже через 24 ч после заражения, а через 48-72 ч в клеточной культуре обнаруживаются многоядерные гигантские клетки, в которых можно обнаружить внутриядерные включения. Специфичность этих изменений доказывают ИФ или РН. Наблюдение за культурой клеток проводят до 6-7 дн Для первичного выделения вируса так же пригодны клетки Vero
Индикация и идентификация вируса
Обнаружение специфических телец-включений. Вирус ИЛТ размножается в эпителиальных клетках слизистой оболочки гортани, трахеи,клоаки, вызывая острое воспаление этих оболочек с образованием внутриядерных включений. Включения обнаруживаются до наступления некроза эпителия между 1-м и5-м дн после интратрахеального заражения цыплят. В мазках из конъюнктивы включения находят через 48 ч после заражения. Ядро, содержащее включение,обычно увеличено, отмечается гиперхроматия ядерной оболочки. Включения имеют округлую форму, иногда форму диплококков и занимают 1/2 -1/3 клеточного ядра.Вокруг включения видна неокрашенная зона, что считается характерным. Болезнь можно диагностировать на основании обнаружения внутри ядерных включений. Для этого на предметных стеклах готовят мазки из соскобов эпителия слизистой оболочки, фиксируют в абсолютном метиловом спирте в течение 3-5 мин окрашивают раствором краски Гимза (1капля краски на 1 мл дистиллированной воды) в течение 2 ч при 37°С, затем мазки промывают, обрабатывают абсолютным метиловым спиртом,снова промывают, высушивают и просматривают. В положительных случаях цитоплазма эпителиальных клеток окрашивается в бледно-голубой цвет, ядерные оболочки таких клеток более темные, внутриядерные включения четко видны,светло- красного цвета, по форме варьируют (шарообразные или колбасовидные),окружены ясно видимыми светлыми ободками. Количество их в ядре от 1 до 4.Указанный метод позволяет иногда в течение 3-4 ч диагностировать ИЛТ даже при атипичном проявлении. Вероятность обнаружения телец-включений в патологическом материале существует только в начальной фазе болезни - между 2-7 дн.
ИФ. Позволяет обнаружить вирусный АГ при помощи специфической флюоресцирующей сыворотки в мазках из слизистой оболочки трахеи,конъюнктивы от больных цыплят (в период острого течения болезни), из пораженной ХАО и инфицированных культур клеток. Реакцию ставят по общепринятой методике.Чаще используют прямой метод. Положительную ИФ в мазках от больной птицы наблюдают в период острого течения болезни, когда обнаруживаются внутриядерные включения и можно выделить вирус на КЭ.
Биопроба. Ставят ее на цыплятах 30-90- дн возраста путем аппликации вируссодержащего материала на слизистую оболочку гортани, трахеи,глаз, носа, подглазничного синуса, клоаки. При наличии вируса в исследуемом материале у зараженных цыплят на 6-12 дн развиваются типичные клинические признаки экспериментальной инфекции. При инокуляции материала в подглазничный синус в положительных случаях развивается синусит с отеком, выделениями из носовых ходов и слезотечением. Положительная реакция на клоачную пробу проявляется с 3-го по 8-й дн, но чаще на 4-5 дн в виде отечности слизистой оболочки - фабрициевой сумки и катарального, геморрагического или фибринозного воспаления.
Наблюдение за зараженными цыплятами ведут до 14 дней. Чаще всего заражение проводят на слизистую оболочку трахеи и клоаки, так как этот метод позволяет определить вирулентность штамма, а также провести дифференциацию от вирусов, вызывающих сходное поражение ХАО у инфицированных КЭ. При интратрахеальном заражении 4-нед цыплят вирулентным штаммом CS-1 вируса ИЛТ. Наибольший титр вируса в тканях трахеи (106 БОЕ/г) установлен на 2-4-е сут. Позднее количество вируса резко снижалось и на 7 дн его не обнаруживали,хотя антиген вируса в эпителии трахеи и в большом количестве выявляли еще на7-8 сут с помощью ИФ.
Последнее время естественные инфекции все чаще протекают нетипично, абортивно, хронически или даже бессимптомно. Выделяемые штаммы также менее патогенны для КЭ, не всегда приводят к их гибели и даже не всегда вызывают патологические изменения на слизистых оболочках при непосредственном ведении исследуемого материала.
РН. Реакцию ставят по общепринятой методике. Чаще всего в диагностической практике используют метод: - разведение вируса и постоянная доза сыворотки. Результаты РН выражают в индексах нейтрализации. Принято индексы нейтрализации от 1 до 9 считать отрицательными, от 10 до 49 -сомнительными, от 50 и выше - положительными. РН можно проводить и в культуре клеток ПЭК и 3-8 дн цыплятах.
РДП. Для идентификации возбудителя в РДП используют набор куриных антисывороток, полученных к различным вирусам птиц. РДП ставят по общепринятой методике. Для РДП при диагностике ИЛТ птиц 1,5%-ный агаровый гельготовят на верональном буферном растворе с рН 7,2 следующим образом: в 100 мл горячей дистиллированной воды растворяют 1,84 г веронала, после охлаждения доливают дистиллированной водой до 1000 мл и растворяют в полученном растворе 10,3 г мединала. Раствор хранят при 4°С. Реакция проста по технике выполнения и позволяет выявлять примерно 75% положительных случаев, установленных при помощи заражения эмбрионов. РДП специфична, но недостаточно чувствительна, ее используют главным образом для ретроспективной диагностики среди взрослых кур.
Приготовление гипериммунных сывороток и антигенов.Гипериммунные вирус-нейтрализующие сыворотки получают на кроликах по следующей схеме. Вирус (суспензии ХАО 1:10 после центрифугирования при 2500 мин 1 в течение 30 мин) вводят кроликам внутривенно в течение 3 нед по 3 раза в неделю(через 1 дн): в первую нед - по 2 мл, во вторую - по 3, в третью - по 4 мл.Через 7 нед после первичной иммунизации кролику внутрибрюшинно инъецируют 10 мл вируса, а на следующий день - 15 мл внутривенно. Через 7 дн после последнего введения АГ кроликов обескровливают. Гипериммунные кроличьи сыворотки используют в РН для типирования вируса ИЛТ.
Получение гипериммунных преципитирующих сывороток на птице. Центрифугированную суспензию вируссодержащей ХАО в разведении 110 вводят взрослым петухам в подкрыльцовую вену в объеме 1-2 мл по схеме 4 инъекции с промежутками в 1 день, 7 дн отдыха, 4 инъекции с промежутками в 1 день. На 6-йдн после последней инъекции пробно берут кровь из сердца, в случае неактивности сыворотки проводят трехкратное введение вируса с суточными интервалами, на 6-ой день вторично берут пробу крови. Установлено что препараты очищенного вируса ИЛТ, полученные в градиенте плотности глицерин-тартрата,более пригодны для выделения вирионной ДНК, тогда как препараты, очищенные в перколе, лучше использовать в качестве специфического АГ для ИФА и получения специфических сывороток. По данным ЭМ препараты вируса ИЛТ, очищенные в перколе, практически не содержат примесей клеточных компонентов (везикул).
Идентификация вируса с помощью мон АТ. По чувствительности ИФА с мон АТ сопоставим с методом выделения вируса, но более быстрым и более чувствительным по сравнению с ИФ В ИФА используют кроличьи поликлональные AT и мышиные мон АТ.
Серодиагностика и ретроспективная диагностика. В нетипичных случаях, особенно при хроническом течении инфекции, провести диагностику позволяет установление роста титра антител при исследовании парных сывороток.Однако такого рода исследования проводятся главным образом с целью получения данных, свидетельствующих о перенесении заболевания данной популяцией и указывающих на степень распространенности возбудителя на определенной территории. Пробы сыворотки от птицы исследуют дважды - через 14-28 дн интервал. Повышение титра антител к вирусу и числа положительно реагирующих птиц в стаде свидетельствует о наличии и распространении инфекции в хозяйстве,а сохранение или снижение уровня AT - о прошедшей инфекции. Для серологического исследования кровь берут на 14-28-й дн от начала болезни не менее чем от 5-10 птиц по 5 мл от каждой. До начала исследования сыворотку сохраняют в замороженном состоянии при минус 20-70°С. Сыворотки больных и переболевших птиц, а также контрольные инактивируют при 56°С 30 мин.
Приготовление антигенов для РН и РДП. ХАО КЭ с характерными для данного вируса поражениями гомогенизируют с равным количеством буферного изотонического раствора с рН 7,2-7,4, к которому добавлены антибиотики из расчета по 100 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл раствора. Суспензию Центрифугируют при 3000 мин 1 20 мин. Надо садочную жидкость сливают и используют в качестве антигена, если она содержит вируса не менее 105 ЭИДзо/млАГ сохраняют в замороженном состоянии. Предложена следующая методика концентрации и очистки вируса вируссодержащий материал концентрируют полиэтиленгликолем с молм 6000, конечная концентрация его в вирусосодержащей суспензии должна быть равна 7% Концентрирование ведут при 4°С в течение 3 ч, центрифугируют концентрированный вирус при 3000об/мин. 30 мин. Инфекционная активность полученного вируса - 1 О6-107 ЭИД 50/мл
РН. Наиболее чувствительна по сравнению с РДП и РРИД. Она выявляет специфические AT у 96-98% инфицированных птиц независимо от формы течения заболевания. Однако эта реакция трудоемка и требует значительного количества КЭ. На КЭ или культурах клеток реакцию ставят по общепринятой методике, чаще используют модификацию постоянная доза сыворотки и различные разведения вируса. Число рядов соответствует числу испытуемых сывороток плюс 2 ряда контроля (с нормальной и иммунной сыворотками), а число пробирок в ряду -числу разведении вируса. После контакта (1ч при комнатной температуре) смесь сыворотки с каждым разведением вируса инокулируют не менее чем 4 КЭ на ХАО по0,2 мл. Эмбрионы инкубируют при 37°С в течение 6 дн. При вскрытии выявляют специфические изменения на ХАО. В РН рекомендуется использовать не разведенные сыворотки. Оценку результатов проводят по индексу нейтрализации. Сыворотку с ИН10 или меньше, считают отрицательной, а с индексом больше 10 – положительной.
РДП. Проводят по общепринятой методике, используя стандартный АГ Эта реакция может выявить 25-50% переболевших птиц. Однако простая техника постановки ее и быстрое получение результатов дают возможность с минимальными затратами средств и времени обследовать большое количество птицы. Специфический антиген готовят из вакцинного вируса ИЛТ клона НТ. Вируссодержашую суспензию - центрифугат гомогенизированных ХАО - концентрируют, используя 1%-ный раствор полиэтиленгликоля на дистиллированной воде, либо полиэтиленгликоль (ПЭГ-6000) при добавлении в суспензию из расчета 7%.
Антисыворотку к вирусу ИЛТ получают гипериммунизацией морских свинок и птиц. В первом случае используют концентрированный вирус ИЛТ ститром не ниже 108ЭИД5о/мл-, которым иммунизируют морских свинок по следующей схеме: первая иммунизация в объеме 0,1 мл внутрикожно в плантарную поверхность обеих лапок, вторая иммунизация - через 7-9 дн в объеме 1 мл подкожно в область верхней губы; последующие 2 инъекции - через 14-16 и 21-23 дн после второй проводят аналогично. Через 10 дн после последнего введения АГ морских свинок тотально обескровливают. Уровень AT в РДП составлял, как правило, 1 16 и выше,в лиофилизированном состоянии сыворотки сохраняли свою активность 2 г.
Птиц (молодок и петухов в возрасте 90-120 дн) гипериммунизируют по схеме: первый и второй раз (через 2 дн) иммунизируют специфическим АГ внутривенно в объеме 1 мл, третий раз через 16 дн и четвертый раз через 30 дн -проводят интратрахеально в таком же объеме. Через 15 дн после последней иммунизации берут пробу крови и исследуют на активность и специфичность. Если активность сыворотки в РДП со специфическим АГ 1:32 и выше,то у такой птицы тотально (из сердца) берут кровь, сыворотку от которой лиофилизируют и используют для выявления AT в органах и тканях больных и погибших птиц. Если титр специфических ПА в пробе сыворотки окажется ниже чем 1:32, то птицу иммунизируют еще раз вирулентным вирусом ИЛТ в разведении 1:100 интратрахеально в объеме 0,5 мл. Через 10-12 дн птиц обескровливают и сыворотку лиофилизируют.
В качестве растворителя для приготовления геля используют 0,1М забуференный физ-раствор NaCl pH 7,2-7,4; забуференный фосфатный раствор состоит из 9 частей ОД5М раствора NaCl и 1 ной части 0,15М фосфатного буфера срН 7,2 по Сервису, веронал-ацетатный буфер с рН 8,6 с ионной силой 0,1 иборатный буфер рН 8,4-8,6. Гель на этих буферных растворах готовят из расчета:1,5 гагара на 100 мл растворителя. Растворяют агар в течение 1,5-2 ч в кипящей водяной бане, добавляя в расплавленный агар консервант (риванол, азид натрия идр.). Горячий агар разливают по 3 мл на предметные стенки или по 35 мл в чашки Петри, расположенные строго горизонтально. Как только агар затвердеет,пластинки можно использовать в РДП. Таким образом, для диагностики ИЛТ рекомендуется РДП на агаровом геле, приготовленном на боратном, либо фосфатном буферных растворах. РДП пригодно для выявления специфических AT в крови больных и переболевших птиц, а также вирусного АГ ИЛТ в органах погибших птиц.Разработаны условия получения специфического вируса ИЛТ, активность его РДП 1:4-1:32, а в твердофазном ИФА 1:265-1:4000.
ELISA. Оказался более чувствительным, чем РН, по чувствительности приближается к ИФ У отдельных экспериментально зараженных цыплят с помощью ELISA и РИФ удавалось выявить AT в более ранние сроки, чем в РН. Разработан твердофазный ИФА для выявления специфических AT к вирусу ИЛТ в сыворотках крови вакцинированных птиц. Методом шахматного титрования была выработана сенсибилизирующая доза антигенов и разведения иммунопероксидазного конъюгата. В ИФА можно выявлять специфические антитела в титрах 1:100-1:200 в сыворотках крови вакцинированных птиц. Аналогичные титры в РН и РДП соответственно составляли 1:8-1:32 и 1:2-1:16 (12). ELISA и РН (микрометод) успешно применяли для обнаружения AT в стадах с субклиническим течением ИЛТ. Обнаружить Поствакцинальные AT к вирусу болезни в сыворотках цыплят с помощью ELISA удается через неделю после вакцинации. Также предложен усовершенствованный метод ELISAпутем введения в реакцию авидин-биотин-ферментного комплекса. Он пригоден и для оценки поствакцинального иммунитета .
Дифференциальная диагностика. При постановке диагноза на ИЛТ необходимо исключить НБ, оспу, ИБК, заразный насморк, хронический пастереллез, респираторный микоплазмоз и др.
Иммунитет. Заболевание сопровождается длительным или пожизненным вирусоносительством. Из трахеи переболевших птиц вирус выделяли в течение 2 лет. Смывы с трахеи обладали вирус нейтрализующей активностью на 7-8-й дн после заражения. При ИЛТ установлено важное значение клеточного иммунитета. Иммуногенность вакцины зависит от ее реактогенности, отмечена тесная корреляция между напряженностью иммунитета и титром ВНА (в культуре клеток почки КЭ). В ряде случаев иммунитет наступал раньше, чем появлялись гуморальные AT. Формирование ВНА и гиперчувствительность замедленного типа не коррелирует с напряженностью иммунитета у вакцинированной птицы.
В Российской Федерации и странах СНГ применяют сухую вирус-вакцину из шт ЦНИИПП. Ими предложен метод иммунизации - втирание вакцины в слизистую оболочку верхнего свода клоаки. Иммунитет наступает через 7-10 дней и сохраняется у большинства птиц в течение всего срока их использования. Разработан и аэрозольный метод вакцинации данным препаратом. Предложена также живая вирус вакцина из природно-ослабленного штамма ВНИИБП, которую можно применять путем втирания в слизистую оболочку клоаки и аэрозольно. При использовании этого штамма с ГА активностью 1 128-1 512 нанесением его на конъюнктиву в дозе 1000 ЭИДзо достигался высокий эффект, который оценивался по уровню анти ГА вРЗГА Сероконверсия не менее 80% и среднегеометрический титр AT более 4 log свидетельствуют о напряженном иммунитете.
Помимо живых культуральных вакцин, в Японии применяется клеточно-ассоциированная живая вакцина из вируса ларинготрахеита СЕ в вирусинфицированных клетках которой содержится значительно больше вирусспецифических белков, чем в свободных вирионах. Иммунитет у привитой птицы развивался на 6-й день после иммунизации. Даже в 10-кратной дозе вакцина оказалась безопасной для цыплят.
Предложена также живая вакцина против ИЛТ и болезни Марека,которая индуцировала иммунитет к обоим вирусам при подкожном и внутримышечном введениях. Показана эффективность одновременной вакцинации цыплят против НБ иИЛТ Оказалось, что вакцинный штамм Ла-Сота не оказывает тормозящего влияния нарепродукцию шт ВНИИБП вируса ИЛТ в КЭ. Биологическая активность ииммуногенность вирусвакцины ИЛТ кур из клона НТ не изменялась при хранении ее в течение 12 мес при температуре 2-6°С.
Предпочтительный метод иммунизации - закапывание вакцины на конъюнктиву или применение ее в виде аэрозоля Вакцинация аэрозолем, содержащим вакцинный вирус, может сопровождаться нежелательными последствиями особенно при наличии в хозяйстве микоплазменной инфекции. При аэрозольной вакцинации иммунитет развивается через 4-5 дн и сохраняется до года. В настоящее время вРФ применяют вакцины ВНИИБП и ВНИИВВиМ Первая после двукратного аэрозольного применения (5-7,5 lg ЭИД 5о) создавала иммунитет у всех 5-6 - нед цыплят яичных стад и у 80% цыплят мясных пород кур. Через 4,5 мес после вакцинации у 90% кур сохранялся напряженный иммунитет. Вакцину ВНИИВВиМ готовят из ат-тенуированного шт НТ, она менее реактогенна при аэрозольном применении. Несмотря на высокую биологическую активность и ареактогенность вакцины против ИЛТ из клона НТ, не рекомендуется использовать ее для вакцинации разновозрастных цыплят и там, где нет необходимых условий для создания нужной ее концентрации в птичнике. Вакцина Против ИЛТ из клона НТ при клоачном методе применения в дозе 11240 ЭИД 5о и выше формирует у 30-40 дн цыплят напряженный иммунитет после однократной вакцинации.
Относительно эффективности инактивированной вакцины в литературе имеются противоречивые данные Для изготовления инактивированного препарата используют р-пропилактон, этилэнимин, формалин. Однократная Иммунизация цыплят инактивированной эмульсин-вакциной сообщает устойчивость цыплят к заражению в течение 12 мес. Таким образом, получена эффективная инактивированная вакцина, которую рекомендовано применять в хозяйствах с частыми вспышками ИЛТ .
Генно-инженерные вакцины. Независимо от методов аппликации живой вирус-вакцины у птицы наблюдается довольно длительное носительство вакцинного вируса. Аттенуированные вакцины могут быть причиной возникновения латентной формы инфекции. Разрабатываемые генно-инженерные вакцины лишены этого недостатка. В сочетании с гигиеническими мероприятиями такие вакцины могли бы привести к искоренению ИЛТ к 2000г. в птицеводческих хозяйствах.Описаны методы конструирования мутантов вируса ИЛТ, у которых ген ТК (тимидинкиназы) инактивирован мутациями разного типа: делециями (например участка ДНК между 2 сайтами Narl), вставками чужеродной ДНК или делецией и вставкой. Эти мутанты не продуцируют функциональную ТК и являются аттенуиро-ванными. В ген ТК вируса ИЛТ можно встраивать гетерологичные гены,кодирующие АГ патогенов птиц: вирусов БМ, НБ, ИБК, ретровирусов и т.д. Такие Варианты вируса ИЛТ можно использовать в качестве вакцинных векторов,индуцирующих иммунный ответ. Получен положительный результат при использование для специфической профилактики ИЛТ очищенного афинной хроматографией гликопротеина.
Оценка поствакцинального иммунитета. Куры, переболевшие инфекционным ларинготрахеитом, в естественных условиях приобретают практически пожизненный иммунитет. Установлено, что двукратная ассоциированная аэрозольная иммунизация птиц против НБ, ИЛТ и оспы не угнетает клеточных и гуморальных показателей иммунитета. Большинство исследователей поствакцинальный иммунитет оценивают по уровню ВНА, а напряженность - путем контрольного заражения.Установлена тесная корреляция между напряженностью иммунитета и титром в первые 2 недели после вакцинации. В ряде случаев цыплята могут быть устойчивы к заражению, но серонегативны, что свидетельствует о том, что иммунное состояние наступает раньше, чем появляются AT в крови.
В сыворотках крови вакцинированных кур на 10-14-й дн обнаруживают ВНА. В небольших титрах они у птиц выявлялись в РН через 55 нед после вакцинации. Установлена прямая зависимость между уровнем защиты кур после вакцинации и титрами ВНА. При титре поствакцинальньгх антител Г 76, Мб, 1:10и Г8 процент заболеваемости птицы после экспериментального заражения составлял 0,45, 55 и 100% соответственно. Птица, иммунизированная клоачно, не заболевает при интратрахеальном заражении, а выжившая после интратрахеальной вакцинация остается невосприимчивой при заражении в клоаку. В связи с этим поствакцинальный иммунитет оценивают по наличию ВНА в сыворотке крови вакцинированных кур, а также по результатам биопробы (клоачная реакция). Для ориентировочной оценки напряженности иммунитета птиц после вакцинации против ИЛТ можно использовать РДП и РИЭФ, но они менее показательны. Связь титров AT с вирусоносительством и вирусовыделением не изучена.
Пассивный иммунитет. Заражение 1-дневных цыплят, полученных от вакцинированных птиц, приводило к 40%-ной заболеваемости и смертности; гибель цыплят, полученных от не иммунных родителей, составляла 100%. Куры,содержащие ВНА в титре 1:76 не защищают потомство и в организме их возможна репродукция вируса в раннем возрасте.
Сведения о возбудителе. Вирус впервые выделил Бичь в 1930 г в США
Морфология и химический состав. Геном вируса ИЛТ имеет длину 155 тыс пни состоит из длинной уникальной последовательности 1Д (120 тыс пн) и короткой уникальной последовательности Us (17 тыс п н ). Гликопротеины вируса ИЛТ были выделены из экстрактов вирусинфицированных клеток и очищены с помощью лектин-аффинной хроматографии Гликопротеины предохраняли 83 % птиц от заражения их патогенным вирусом. Гликопротеин В (gB) является первым структурным белком вируса ИЛТ птиц Клонирован, секвенирован ген этого белка.
Устойчивость. Вирус чувствителен к липолитическим агентам,теплу и различным де-зинфектантам Он длительно сохраняет свою активность влиофилизированном состоянии или при - 20-60°С Температура 55°С разрушает вирус в течение 10-15 мин, а 38°С - за 48 ч В вируссодержащей трахеальной слизи больного цыпленка вирус разрушается в течение 44 ч при температуре 37°С, а в ХАО при 25°С в течение 5 ч В патологическом материале (трахее от больных кур)при температуре - 8-10°С он сохранялся более 370 дн В замороженных тушках больных и вынуждено убитых кур, хранившихся при температуре - 10, 18, 28°С ,вирус оставался активным более 19 мес, на поверхности скорлупы в условиях термостатаин активируется через 12 ч, а в зараженных птичниках сохраняется не более 9 дн Полностью инактивируется в 1 %-ном растворе креола в течение 30 с %
АГ вариабельность и родство. Все птичьи герпесвирусы на основании перекрестной РН сгруппированы в 11 разных групп. Штаммы вируса ИЛТ различаются по вирулентности для птиц и КЭ, тропизму, скорости выделения из клеток в тканевой культуре, устойчивости при хранении, авидности,молекулярно-структурными особенностями Иммунологических различий среди штаммов вируса ларинготрахеита не обнаружено, хотя некоторые отклонения в способности нейтрализоваться гипериммунными сыворотками описаны у штаммов различной вирулентности.
Локализация вируса. Вирус обнаруживают главным образом вдыхательных путях, в меньшем количестве в печени и селезенке. При интратрахеальном заражении 30 дневных цыплят его выделяли из трахеи и носовых ходов 7 дн, при ректальном заражении находили в фабрициевой сумке и трахее в течение 3 дн. У птиц-реконвалесцентов установлено длительное вирусоносительство. Из трахеи переболевших птиц вирус выделяли 2 дня. Послеострой фазы ИЛТ может наступить латентный период с сохранением генетического материала вируса в ДНК клеток ганглия тройничного нерва. При различных воздействиях может произойти реактивация инфекции с выделением вируса во внешнюю среду.
АГ активность. ВНА у зараженных кур появляются со 2-3 недели после заражения, титр их достигает максимума к 5-му дню и сохраняется до 8-21 месяцев.
Экспериментальная инфекция. Заразить восприимчивую птицу легко путем аппликации вируссодержащего материала на слизистую оболочку гортани, трахеи, глаз, носа, подглазничного синуса и клоаки. На 6-12 дн у зараженных цыплят развиваются типичные симптомы болезни. На 3-10 дн после внутри трахеальной инокуляции вируса у кур-несушек отмечаются признаки умеренного респираторного заболевания. На 4-й дн в ткани трахеи и носовой полости обнаруживается вирус. В период между 19 и 59 дн после заражения с помощью ЦПР периодически выявляется вирус. Ганглии тройничного нерва являются основным местом локализации вируса. У экспериментально зараженных СПФ-цыплят вакцинным шт. SA-2 вируса ИЛТ вирусный АГ в трахеальных смывах определялся до 7-го дн после заражения, a AT против вируса в трахеальных смывах с 5-го дн после заражения. Иммуноглобулины класса А появлялись на 6-й день после заражения, а ВНА - только на 14 день. Вирус вызывал заболевания у индеек в возрасте 3-4 нед и 2-10 мес. Больные индейки могут быть источником заражения кур. Данные о восприимчивости голубей к вирусу противоречивы Павлины и фазаны оказались чувствительными к вирусу, причем чувствительность фазанов была выше Кролики, морские свинки и белые крысы резистентны.
Вирусовыделение. В экспериментальных условиях инфицированные птицы начинают экскретировать вирус через 8 дней после заражения Прединфекционный период может длиться 2 дня, а выделение вируса наблюдалось в течение 6 дн. Клинические признаки у зараженной птицы обычно появляются на 6 дн. В организме переболевших птиц вирус ИЛТ, как и многие другие герпесвирусы, может находиться в латентной форме. Полевые штаммы ,как и вакцинные обладают свойством персистировать в нервной системе. Вакцинный вирус легко передается горизонтально. Поэтому при применении вакцины лучше иммунизировать всех цыплят птицефермы.
Культивирование. Вирус культивируется на ХАО эмбрионов кур,уток, индеек, некоторых первичных и перевиваемых культурах клеток, неразвивается в эмбрионах голубей и морских птиц. На ХАО образуются фокусные поражения 2 типов крупноузелковые с непрозрачной белой периферией инекротическим центром и мелкоузелковые - без некроза. Узелковые поражения появляются на всей поверхности ХАО, а очаговые только на месте инокуляциивируса. В зараженных клетках ХАО образуются внутриядерные включения, а иногда гигантские клетки. В культурах линий СПЭВ, FJ, клеток фибробластов куриных эмбрионов, почки цыплят, утят, эмбрионов свиньи, новорожденных крольчат вирус вызывает к 3-4 дн ЦПИ, характеризующиеся округлением и зернистостью клеток, лизисом их с последующим отторжением. В клетках СПЭВ формируются цитоплазматические включения и образуются многоядерные клетки. Внутриклеточные включения обнаруживаются через 12 ч и к 30-36 ч после заражения достигают наивысшей концентрации. В инфицированных культурах клеток вирус вызывает образование бляшек.
ГА свойства. Вирус, репродуцированный в КЭ, не обладает ГА активностью Она проявляется иногда в случае культивирования вируса в первичной культуре почки цыплят.
Эпизоотологическая характеристика. Источники и пути передачи инфекции. Источник инфекции -больная и переболевшая ИЛТ птица, которая длительное время (свыше 2 лет)остается вирусоносителем. Вирус от больных птиц можно выделить в течение 7 дн после появления симптомов болезни, после чего отдельные переболевшие птицы остаются вирусоносителями и периодически выделяют вирус, не обязательно при этом с переходом болезни в клиническую форму. Инфицирование может происходить и половым путем. Возможна передача вируса через зараженную скорлупу яйца. В условиях инкубатора вирус сохраняет инфекционность до 96 часов. После обработки яиц парами формальдегида он погибает через 40 минут. После острой фазы инфекции может наступить латентный период с сохранением генетического материала вируса в ДНК клеток ганглия тройничного нерва. При различных воздействиях может произойти реактивация инфекции с выделением вируса во внешнюю среду. Благоприятным фактором в плане искоренения инфекции в птицеводческих хозяйствах являются высокая степень видоспецифичности вируса, необходимость тесного контакта кур для распространения инфекции, быстрая инактивация вируса вне организма птиц,генетическая стабильность вируса, отсутствие размножения вируса в трахее при наличии местного специфического клеточно-опосредованного иммунитета.
Спектр патогенности в естественных условиях. В естественных условиях вирус поражает кур всех возрастов Фазаны и индейки также чувствительны к вирусу ИЛТ
Клинические признаки и патологоанатомические изменения.Инкубационный период колеблется от 2 до 30 дней. Длительность его зависит от вирулентности, дозы вируса, метода введения в организм и физиологического состояния птицы. Наиболее короткий инкубационный период , равный 40 ч , отмечен при интратрахеальном заражении. Болезнь протекает сверхостро, остро и хронически. Различают легкую и атипичную формы болезни, а по локализации поражений -ларинготрахеальную и конъюнктивальную формы. Первая обычно протекает остро и сопровождается кашлем, удушьем, хрипом при дыхании. Катаральное или фибринозное воспаление слизистых оболочек можно наблюдать в носовой полости иинфраорбитальных синусах Слизистая оболочка в этих случаях гиперемирована набухшая, иногда пронизана мелкими точечными кровоизлияниями. В ротовой полостина слизистой оболочке можно находить легко отделяемые налеты беловатого цвета локализующиеся у корня языка, в углах клюва, окружности неба и у входа в гортань и глотку В ряде случаев отмечают катаральный фарингит На вскрытии изменения находят главным образом в гортани и трахее. В просвете гортани обнаруживают казеозную пробку. После ее удаления слизистая оболочка гортанинеровная, красноватая, отечная, утолщенная. Конъюнктивальная форма чаще наблюдается у цыплят и характеризуется катаральным или фибринозным конъюнктивитом. Эта форма может протекать только с поражением конъюнктивы или в сочетании с ларинготрахеальной формой болезни У части птиц отмечают отек век,особенно нижнего У некоторых кур и цыплят развивается фибринозное воспаление конъюнктивы с отложением в конъюнктивальный мешок фибринозно-казеозных масс склеиванием век, помутнением роговицы, иногда с развитием панофтальмита. Изменения в легких при ИЛТ находят обычно у небольшого количества птиц. В некоторых случаях они ограничиваются только бронхами, в которых развивается катаральное, реже фибринозное воспаление, иногда в просвете бронхов обнаруживают сгустки крови или фибринозно-казеозные пробки.
Более характерные признаки ИЛТ отмечаются у цыплят-бройлеров в возрасте 4-7 нед и у кур-несушек в возрасте 18-76 нед. В ряде случае водно временно с бронхитом выявляют катаральную пневмонию в виде небольших сероватых уплотненных участков, иногда с мелкими очагами некроза желтоватого цвета Поражение воздухоносных мешков встречается сравнительно редко Однако при экспериментальном воспроизведении инфекции, особенно при интратрахеальном методе заражения, аэросаккулит часто находят у значительного количества птиц. Стенка воздухоносных мешков при очаговом или диффузном поражении утолщена,частично или полностью непрозрачные сосуды ее переполнены кровью. В полости воздухоносных мешков находят серозный пенистый экссудат со сгустками фибринаили зернами фибринозно-казеозных масс В эпителиальных клетках трахеи уже через 12ч после заражения находят внутриядерные включения типа А. При обычном окрашивании они представляются однородными, а при серебрении выявляются аргининофильные гранулы.
При ларинготрахеальной форме болезни характерные изменения отмечают в гортани и трахее. Слизистая оболочка этих органов гиперемирована, отечна, эрозирована, с кровоизлияниями, а просвет их часто бывает заполнен катаральным или катарально-геморрагическим экссудатом. В большинстве случаев в гортани находят фибринозно-казеозные массы, закупоривающие просвет. При некоторых энзоотиях обнаруживают катаральное воспаление слизистых оболочекносовой и ротовой полостей, а на корне и уздечке языка фибринозные наложения.У некоторых кур наблюдают увеличение селезенки, катаральное воспаление тонкого кишечника, фабрициевой сумки и клоаки. В бронхах и легких поражения встречаются редко, в виде катаральной бронхопневмонии. При конъюктивальной форме отмечают серозный или фибринозный конъюнктивит с отложением в конъюнктивальный мешокказеозных масс, помутнение роговицы и поражение глазного яблока.
Гистологические изменения. Соответствуют картине вскрытия. В гортани и трахее находят серозно-катаральное или фибринозно-геморрагическое воспаление слизистой оболочки. В начале болезни выявляют гиперемию сосудов, дистрофию покровного эпителия и отек слизистой оболочки, в более поздние сроки некроз и десквамация респираторного эпителия, инфильтрацию слизистой оболочки или мфоидно-гистиоцитарными элементами и пе-риваскуяярные кровоизлияния. В отдельных участках слизистая бывает некротизирована до хрящевого кольца. Вирус размножается в эпителиальных клетках слизистой оболочки гортани, трахеи,конъюнктивы, легких, воздухоносных мешков, клоаки и народу с воспалительной реакцией образует внутриядерные включения. Включения обнаруживают до наступления некроза эпителия между 1-5-м дн после заражения. Форма их округлая, овальная или продолговатая, количество в одре 1-4 , окружены светлым ободком. Описано спонтанное массовое некротическое поражение тимуса, фабрициевой сумки и селезенки у 40-дн цыплят-бройлеров с признаками анемии. При вскрытии обнаружено уменьшение размера тимуса и фабрициевой сумки, которые имели темно-желтый или коричневый цвет, отмечалась также диффузная аденоэктазия железистого желудка.При гистологическом исследовании наблюдали очаги фибрино-гнойного воспаления инекроза в тимусе, фабрициевой сумке и селезенке В гистиоцитах и лимфоцитах этих органов обнаружены одиночные крупные внутриядерные тельца-включения. С помощью трансмиссионной электронной микроскопии в набухших ядрах с периферическим расположением хроматина гистиоцитов тимуса зафиксировано наличие герпесвирусных частиц. При остром течении болезни вирус ИЛТ в 85-86% случаев обнаруживали в инфицированных клетках трахеи и гортани, в 80-88 % - в инфицированных клетках крупных бронхов и лишь в 60 - 62 % - в инфицированных клетках мелких бронхов и бронхиол. Вирус ИЛТ в 76-84 % случаев удается выделить из смывов носоглотки,гортани и трахеи. При подостром и хроническом течениях положительные результатыполучали при исследовании инфицированных клеток гортани и трахеи (96 %),бронхов и бронхиол (85 %), смывов носоглотки, гортани, трахеи (72-86 %), ЖКТ(до 60%) и печени (8-12%). Таким образом при хроническом течении болезни положительные результаты по выделению вируса ИЛТ выше, чем при его остром течении, исключая печень. Тем самым диагностическая надежность метода вирусовыделения при исследовании органов птиц с разной степенью выраженности патологических изменений составляет от 85 % (при остром течении) до 96% (приподостром и хроническом течении заболевания). Однако метод вирусовыделения,обладая высокой специфичностью имеет существенный недостаток - значительная продолжительность во времени (до 45-52 дн).
Патогенез. Вирус проникает в организм через конъюнктиву, носовую или ротовую полости и репродуцируется в эпителиальных клетках слизистой оболочки гортани и трахеи,вызывая серозно-катаральное воспаление и образование внутриядерных включений. Впораженных эпителиальных клетках происходит быстрое размножение ядер безделения цитоплазмы. Через 24 ч из мест поражения вирус поступает в кровеносную систему. На этой стадии заболевания обнаруживают дистрофию, некроз и десквамацию эпителия слизистой оболочки респираторного тракта, а в просвете трахеи слизистой экссудат с примесью крови. При дальнейшем течении болезни поражения слизистой гортани и трахеи усиливаются не только самим действием вируса, но и в результате происходящих в ней дистрофических изменений.Отмечают сужение просвета дыхательных путей, а часто и образование казеозных пробок, что приводит к полной их закупорке и птица погибает от асфиксии.
Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, клинических признаков болезни, и результатов лабораторных исследований. Часто болезнь протекает атипично, характерные признаки ее слабо выражены или их нет. В таких случаях решающее значение в диагностике приобретают лабораторные методы исследования.
Выделение вируса. Взятие и подготовка материала. Для вирусологического исследования от больных птиц берут экссудат из трахеи, отпавших или вынужденно убитых в начальной фазе болезни между 2-7 дн - слизистые оболочки гортани, трахеи, конъюнктивы, носовых ходов и кусочки легких. Материал замораживают и сохраняют при - 20°С и ниже. Для гистологических исследований материал помещают в 10%-ный раствор нейтрального формалина. Из патологического материала готовят суспензию 1 5 на растворе Хенкса или изотоническом растворе NaС1, центрифугируют при 1500-2000 мин 1 в течение 15мин, к надосадочной жидкости добавляют по 1000 ЕД пенициллина и 500 мкг стрептомицина в расчете на 1 мл выдерживают в течение 3-8 ч при 2-4°С. Затемиспользуют для инокуляции КЭ, культуры клеток или не иммунных к ИЛТ цыплят
Заражение КЭ. Для каждой пробы используют по 10 эмбрионов в9-12 да возраста. Заражают на ХАО Погибших в первые 24 ч после инокуляции эмбрионов не учитывают Оставшихся живых эмбрионов на 6-8-й дн убивают.Макроскопические изменения ХАО появляются через 2,5-3 сут и достигают максимума к 5-6 дн. Штаммы вируса ИЛТ вызывают мелкоузелковые и очаговые поражения ХАО. Узелковые поражения обнаруживаются по всей поверхности ХАО,очаговые - только на месте инокуляции вируса. Необходимо учитывать, что не все штаммы вызывают гибель куриных эмбрионов на 4-6- дн. Для выявления специфических поражений надо провести не менее 3 пассажей, используя ХАО, суспендированную в аллантоисной жидкости предыдущего пассажа.
Выделение вируса надо подтвердить обнаружением телец-включений Зейфрида, РН, РДП,биопробой, а также ИФ и ЭМ.
Заражение культур клеток. Наиболее пригодны в данном случае культуры клеток почек эмбриона и цыплят, в которых первые изменения наблюдаются иногда уже через 24 ч после заражения, а через 48-72 ч в клеточной культуре обнаруживаются многоядерные гигантские клетки, в которых можно обнаружить внутриядерные включения. Специфичность этих изменений доказывают ИФ или РН. Наблюдение за культурой клеток проводят до 6-7 дн Для первичного выделения вируса так же пригодны клетки Vero
Индикация и идентификация вируса
Обнаружение специфических телец-включений. Вирус ИЛТ размножается в эпителиальных клетках слизистой оболочки гортани, трахеи,клоаки, вызывая острое воспаление этих оболочек с образованием внутриядерных включений. Включения обнаруживаются до наступления некроза эпителия между 1-м и5-м дн после интратрахеального заражения цыплят. В мазках из конъюнктивы включения находят через 48 ч после заражения. Ядро, содержащее включение,обычно увеличено, отмечается гиперхроматия ядерной оболочки. Включения имеют округлую форму, иногда форму диплококков и занимают 1/2 -1/3 клеточного ядра.Вокруг включения видна неокрашенная зона, что считается характерным. Болезнь можно диагностировать на основании обнаружения внутри ядерных включений. Для этого на предметных стеклах готовят мазки из соскобов эпителия слизистой оболочки, фиксируют в абсолютном метиловом спирте в течение 3-5 мин окрашивают раствором краски Гимза (1капля краски на 1 мл дистиллированной воды) в течение 2 ч при 37°С, затем мазки промывают, обрабатывают абсолютным метиловым спиртом,снова промывают, высушивают и просматривают. В положительных случаях цитоплазма эпителиальных клеток окрашивается в бледно-голубой цвет, ядерные оболочки таких клеток более темные, внутриядерные включения четко видны,светло- красного цвета, по форме варьируют (шарообразные или колбасовидные),окружены ясно видимыми светлыми ободками. Количество их в ядре от 1 до 4.Указанный метод позволяет иногда в течение 3-4 ч диагностировать ИЛТ даже при атипичном проявлении. Вероятность обнаружения телец-включений в патологическом материале существует только в начальной фазе болезни - между 2-7 дн.
ИФ. Позволяет обнаружить вирусный АГ при помощи специфической флюоресцирующей сыворотки в мазках из слизистой оболочки трахеи,конъюнктивы от больных цыплят (в период острого течения болезни), из пораженной ХАО и инфицированных культур клеток. Реакцию ставят по общепринятой методике.Чаще используют прямой метод. Положительную ИФ в мазках от больной птицы наблюдают в период острого течения болезни, когда обнаруживаются внутриядерные включения и можно выделить вирус на КЭ.
Биопроба. Ставят ее на цыплятах 30-90- дн возраста путем аппликации вируссодержащего материала на слизистую оболочку гортани, трахеи,глаз, носа, подглазничного синуса, клоаки. При наличии вируса в исследуемом материале у зараженных цыплят на 6-12 дн развиваются типичные клинические признаки экспериментальной инфекции. При инокуляции материала в подглазничный синус в положительных случаях развивается синусит с отеком, выделениями из носовых ходов и слезотечением. Положительная реакция на клоачную пробу проявляется с 3-го по 8-й дн, но чаще на 4-5 дн в виде отечности слизистой оболочки - фабрициевой сумки и катарального, геморрагического или фибринозного воспаления.
Наблюдение за зараженными цыплятами ведут до 14 дней. Чаще всего заражение проводят на слизистую оболочку трахеи и клоаки, так как этот метод позволяет определить вирулентность штамма, а также провести дифференциацию от вирусов, вызывающих сходное поражение ХАО у инфицированных КЭ. При интратрахеальном заражении 4-нед цыплят вирулентным штаммом CS-1 вируса ИЛТ. Наибольший титр вируса в тканях трахеи (106 БОЕ/г) установлен на 2-4-е сут. Позднее количество вируса резко снижалось и на 7 дн его не обнаруживали,хотя антиген вируса в эпителии трахеи и в большом количестве выявляли еще на7-8 сут с помощью ИФ.
Последнее время естественные инфекции все чаще протекают нетипично, абортивно, хронически или даже бессимптомно. Выделяемые штаммы также менее патогенны для КЭ, не всегда приводят к их гибели и даже не всегда вызывают патологические изменения на слизистых оболочках при непосредственном ведении исследуемого материала.
РН. Реакцию ставят по общепринятой методике. Чаще всего в диагностической практике используют метод: - разведение вируса и постоянная доза сыворотки. Результаты РН выражают в индексах нейтрализации. Принято индексы нейтрализации от 1 до 9 считать отрицательными, от 10 до 49 -сомнительными, от 50 и выше - положительными. РН можно проводить и в культуре клеток ПЭК и 3-8 дн цыплятах.
РДП. Для идентификации возбудителя в РДП используют набор куриных антисывороток, полученных к различным вирусам птиц. РДП ставят по общепринятой методике. Для РДП при диагностике ИЛТ птиц 1,5%-ный агаровый гельготовят на верональном буферном растворе с рН 7,2 следующим образом: в 100 мл горячей дистиллированной воды растворяют 1,84 г веронала, после охлаждения доливают дистиллированной водой до 1000 мл и растворяют в полученном растворе 10,3 г мединала. Раствор хранят при 4°С. Реакция проста по технике выполнения и позволяет выявлять примерно 75% положительных случаев, установленных при помощи заражения эмбрионов. РДП специфична, но недостаточно чувствительна, ее используют главным образом для ретроспективной диагностики среди взрослых кур.
Приготовление гипериммунных сывороток и антигенов.Гипериммунные вирус-нейтрализующие сыворотки получают на кроликах по следующей схеме. Вирус (суспензии ХАО 1:10 после центрифугирования при 2500 мин 1 в течение 30 мин) вводят кроликам внутривенно в течение 3 нед по 3 раза в неделю(через 1 дн): в первую нед - по 2 мл, во вторую - по 3, в третью - по 4 мл.Через 7 нед после первичной иммунизации кролику внутрибрюшинно инъецируют 10 мл вируса, а на следующий день - 15 мл внутривенно. Через 7 дн после последнего введения АГ кроликов обескровливают. Гипериммунные кроличьи сыворотки используют в РН для типирования вируса ИЛТ.
Получение гипериммунных преципитирующих сывороток на птице. Центрифугированную суспензию вируссодержащей ХАО в разведении 110 вводят взрослым петухам в подкрыльцовую вену в объеме 1-2 мл по схеме 4 инъекции с промежутками в 1 день, 7 дн отдыха, 4 инъекции с промежутками в 1 день. На 6-йдн после последней инъекции пробно берут кровь из сердца, в случае неактивности сыворотки проводят трехкратное введение вируса с суточными интервалами, на 6-ой день вторично берут пробу крови. Установлено что препараты очищенного вируса ИЛТ, полученные в градиенте плотности глицерин-тартрата,более пригодны для выделения вирионной ДНК, тогда как препараты, очищенные в перколе, лучше использовать в качестве специфического АГ для ИФА и получения специфических сывороток. По данным ЭМ препараты вируса ИЛТ, очищенные в перколе, практически не содержат примесей клеточных компонентов (везикул).
Идентификация вируса с помощью мон АТ. По чувствительности ИФА с мон АТ сопоставим с методом выделения вируса, но более быстрым и более чувствительным по сравнению с ИФ В ИФА используют кроличьи поликлональные AT и мышиные мон АТ.
Серодиагностика и ретроспективная диагностика. В нетипичных случаях, особенно при хроническом течении инфекции, провести диагностику позволяет установление роста титра антител при исследовании парных сывороток.Однако такого рода исследования проводятся главным образом с целью получения данных, свидетельствующих о перенесении заболевания данной популяцией и указывающих на степень распространенности возбудителя на определенной территории. Пробы сыворотки от птицы исследуют дважды - через 14-28 дн интервал. Повышение титра антител к вирусу и числа положительно реагирующих птиц в стаде свидетельствует о наличии и распространении инфекции в хозяйстве,а сохранение или снижение уровня AT - о прошедшей инфекции. Для серологического исследования кровь берут на 14-28-й дн от начала болезни не менее чем от 5-10 птиц по 5 мл от каждой. До начала исследования сыворотку сохраняют в замороженном состоянии при минус 20-70°С. Сыворотки больных и переболевших птиц, а также контрольные инактивируют при 56°С 30 мин.
Приготовление антигенов для РН и РДП. ХАО КЭ с характерными для данного вируса поражениями гомогенизируют с равным количеством буферного изотонического раствора с рН 7,2-7,4, к которому добавлены антибиотики из расчета по 100 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл раствора. Суспензию Центрифугируют при 3000 мин 1 20 мин. Надо садочную жидкость сливают и используют в качестве антигена, если она содержит вируса не менее 105 ЭИДзо/млАГ сохраняют в замороженном состоянии. Предложена следующая методика концентрации и очистки вируса вируссодержащий материал концентрируют полиэтиленгликолем с молм 6000, конечная концентрация его в вирусосодержащей суспензии должна быть равна 7% Концентрирование ведут при 4°С в течение 3 ч, центрифугируют концентрированный вирус при 3000об/мин. 30 мин. Инфекционная активность полученного вируса - 1 О6-107 ЭИД 50/мл
РН. Наиболее чувствительна по сравнению с РДП и РРИД. Она выявляет специфические AT у 96-98% инфицированных птиц независимо от формы течения заболевания. Однако эта реакция трудоемка и требует значительного количества КЭ. На КЭ или культурах клеток реакцию ставят по общепринятой методике, чаще используют модификацию постоянная доза сыворотки и различные разведения вируса. Число рядов соответствует числу испытуемых сывороток плюс 2 ряда контроля (с нормальной и иммунной сыворотками), а число пробирок в ряду -числу разведении вируса. После контакта (1ч при комнатной температуре) смесь сыворотки с каждым разведением вируса инокулируют не менее чем 4 КЭ на ХАО по0,2 мл. Эмбрионы инкубируют при 37°С в течение 6 дн. При вскрытии выявляют специфические изменения на ХАО. В РН рекомендуется использовать не разведенные сыворотки. Оценку результатов проводят по индексу нейтрализации. Сыворотку с ИН10 или меньше, считают отрицательной, а с индексом больше 10 – положительной.
РДП. Проводят по общепринятой методике, используя стандартный АГ Эта реакция может выявить 25-50% переболевших птиц. Однако простая техника постановки ее и быстрое получение результатов дают возможность с минимальными затратами средств и времени обследовать большое количество птицы. Специфический антиген готовят из вакцинного вируса ИЛТ клона НТ. Вируссодержашую суспензию - центрифугат гомогенизированных ХАО - концентрируют, используя 1%-ный раствор полиэтиленгликоля на дистиллированной воде, либо полиэтиленгликоль (ПЭГ-6000) при добавлении в суспензию из расчета 7%.
Антисыворотку к вирусу ИЛТ получают гипериммунизацией морских свинок и птиц. В первом случае используют концентрированный вирус ИЛТ ститром не ниже 108ЭИД5о/мл-, которым иммунизируют морских свинок по следующей схеме: первая иммунизация в объеме 0,1 мл внутрикожно в плантарную поверхность обеих лапок, вторая иммунизация - через 7-9 дн в объеме 1 мл подкожно в область верхней губы; последующие 2 инъекции - через 14-16 и 21-23 дн после второй проводят аналогично. Через 10 дн после последнего введения АГ морских свинок тотально обескровливают. Уровень AT в РДП составлял, как правило, 1 16 и выше,в лиофилизированном состоянии сыворотки сохраняли свою активность 2 г.
Птиц (молодок и петухов в возрасте 90-120 дн) гипериммунизируют по схеме: первый и второй раз (через 2 дн) иммунизируют специфическим АГ внутривенно в объеме 1 мл, третий раз через 16 дн и четвертый раз через 30 дн -проводят интратрахеально в таком же объеме. Через 15 дн после последней иммунизации берут пробу крови и исследуют на активность и специфичность. Если активность сыворотки в РДП со специфическим АГ 1:32 и выше,то у такой птицы тотально (из сердца) берут кровь, сыворотку от которой лиофилизируют и используют для выявления AT в органах и тканях больных и погибших птиц. Если титр специфических ПА в пробе сыворотки окажется ниже чем 1:32, то птицу иммунизируют еще раз вирулентным вирусом ИЛТ в разведении 1:100 интратрахеально в объеме 0,5 мл. Через 10-12 дн птиц обескровливают и сыворотку лиофилизируют.
В качестве растворителя для приготовления геля используют 0,1М забуференный физ-раствор NaCl pH 7,2-7,4; забуференный фосфатный раствор состоит из 9 частей ОД5М раствора NaCl и 1 ной части 0,15М фосфатного буфера срН 7,2 по Сервису, веронал-ацетатный буфер с рН 8,6 с ионной силой 0,1 иборатный буфер рН 8,4-8,6. Гель на этих буферных растворах готовят из расчета:1,5 гагара на 100 мл растворителя. Растворяют агар в течение 1,5-2 ч в кипящей водяной бане, добавляя в расплавленный агар консервант (риванол, азид натрия идр.). Горячий агар разливают по 3 мл на предметные стенки или по 35 мл в чашки Петри, расположенные строго горизонтально. Как только агар затвердеет,пластинки можно использовать в РДП. Таким образом, для диагностики ИЛТ рекомендуется РДП на агаровом геле, приготовленном на боратном, либо фосфатном буферных растворах. РДП пригодно для выявления специфических AT в крови больных и переболевших птиц, а также вирусного АГ ИЛТ в органах погибших птиц.Разработаны условия получения специфического вируса ИЛТ, активность его РДП 1:4-1:32, а в твердофазном ИФА 1:265-1:4000.
ELISA. Оказался более чувствительным, чем РН, по чувствительности приближается к ИФ У отдельных экспериментально зараженных цыплят с помощью ELISA и РИФ удавалось выявить AT в более ранние сроки, чем в РН. Разработан твердофазный ИФА для выявления специфических AT к вирусу ИЛТ в сыворотках крови вакцинированных птиц. Методом шахматного титрования была выработана сенсибилизирующая доза антигенов и разведения иммунопероксидазного конъюгата. В ИФА можно выявлять специфические антитела в титрах 1:100-1:200 в сыворотках крови вакцинированных птиц. Аналогичные титры в РН и РДП соответственно составляли 1:8-1:32 и 1:2-1:16 (12). ELISA и РН (микрометод) успешно применяли для обнаружения AT в стадах с субклиническим течением ИЛТ. Обнаружить Поствакцинальные AT к вирусу болезни в сыворотках цыплят с помощью ELISA удается через неделю после вакцинации. Также предложен усовершенствованный метод ELISAпутем введения в реакцию авидин-биотин-ферментного комплекса. Он пригоден и для оценки поствакцинального иммунитета .
Дифференциальная диагностика. При постановке диагноза на ИЛТ необходимо исключить НБ, оспу, ИБК, заразный насморк, хронический пастереллез, респираторный микоплазмоз и др.
Иммунитет. Заболевание сопровождается длительным или пожизненным вирусоносительством. Из трахеи переболевших птиц вирус выделяли в течение 2 лет. Смывы с трахеи обладали вирус нейтрализующей активностью на 7-8-й дн после заражения. При ИЛТ установлено важное значение клеточного иммунитета. Иммуногенность вакцины зависит от ее реактогенности, отмечена тесная корреляция между напряженностью иммунитета и титром ВНА (в культуре клеток почки КЭ). В ряде случаев иммунитет наступал раньше, чем появлялись гуморальные AT. Формирование ВНА и гиперчувствительность замедленного типа не коррелирует с напряженностью иммунитета у вакцинированной птицы.
В Российской Федерации и странах СНГ применяют сухую вирус-вакцину из шт ЦНИИПП. Ими предложен метод иммунизации - втирание вакцины в слизистую оболочку верхнего свода клоаки. Иммунитет наступает через 7-10 дней и сохраняется у большинства птиц в течение всего срока их использования. Разработан и аэрозольный метод вакцинации данным препаратом. Предложена также живая вирус вакцина из природно-ослабленного штамма ВНИИБП, которую можно применять путем втирания в слизистую оболочку клоаки и аэрозольно. При использовании этого штамма с ГА активностью 1 128-1 512 нанесением его на конъюнктиву в дозе 1000 ЭИДзо достигался высокий эффект, который оценивался по уровню анти ГА вРЗГА Сероконверсия не менее 80% и среднегеометрический титр AT более 4 log свидетельствуют о напряженном иммунитете.
Помимо живых культуральных вакцин, в Японии применяется клеточно-ассоциированная живая вакцина из вируса ларинготрахеита СЕ в вирусинфицированных клетках которой содержится значительно больше вирусспецифических белков, чем в свободных вирионах. Иммунитет у привитой птицы развивался на 6-й день после иммунизации. Даже в 10-кратной дозе вакцина оказалась безопасной для цыплят.
Предложена также живая вакцина против ИЛТ и болезни Марека,которая индуцировала иммунитет к обоим вирусам при подкожном и внутримышечном введениях. Показана эффективность одновременной вакцинации цыплят против НБ иИЛТ Оказалось, что вакцинный штамм Ла-Сота не оказывает тормозящего влияния нарепродукцию шт ВНИИБП вируса ИЛТ в КЭ. Биологическая активность ииммуногенность вирусвакцины ИЛТ кур из клона НТ не изменялась при хранении ее в течение 12 мес при температуре 2-6°С.
Предпочтительный метод иммунизации - закапывание вакцины на конъюнктиву или применение ее в виде аэрозоля Вакцинация аэрозолем, содержащим вакцинный вирус, может сопровождаться нежелательными последствиями особенно при наличии в хозяйстве микоплазменной инфекции. При аэрозольной вакцинации иммунитет развивается через 4-5 дн и сохраняется до года. В настоящее время вРФ применяют вакцины ВНИИБП и ВНИИВВиМ Первая после двукратного аэрозольного применения (5-7,5 lg ЭИД 5о) создавала иммунитет у всех 5-6 - нед цыплят яичных стад и у 80% цыплят мясных пород кур. Через 4,5 мес после вакцинации у 90% кур сохранялся напряженный иммунитет. Вакцину ВНИИВВиМ готовят из ат-тенуированного шт НТ, она менее реактогенна при аэрозольном применении. Несмотря на высокую биологическую активность и ареактогенность вакцины против ИЛТ из клона НТ, не рекомендуется использовать ее для вакцинации разновозрастных цыплят и там, где нет необходимых условий для создания нужной ее концентрации в птичнике. Вакцина Против ИЛТ из клона НТ при клоачном методе применения в дозе 11240 ЭИД 5о и выше формирует у 30-40 дн цыплят напряженный иммунитет после однократной вакцинации.
Относительно эффективности инактивированной вакцины в литературе имеются противоречивые данные Для изготовления инактивированного препарата используют р-пропилактон, этилэнимин, формалин. Однократная Иммунизация цыплят инактивированной эмульсин-вакциной сообщает устойчивость цыплят к заражению в течение 12 мес. Таким образом, получена эффективная инактивированная вакцина, которую рекомендовано применять в хозяйствах с частыми вспышками ИЛТ .
Генно-инженерные вакцины. Независимо от методов аппликации живой вирус-вакцины у птицы наблюдается довольно длительное носительство вакцинного вируса. Аттенуированные вакцины могут быть причиной возникновения латентной формы инфекции. Разрабатываемые генно-инженерные вакцины лишены этого недостатка. В сочетании с гигиеническими мероприятиями такие вакцины могли бы привести к искоренению ИЛТ к 2000г. в птицеводческих хозяйствах.Описаны методы конструирования мутантов вируса ИЛТ, у которых ген ТК (тимидинкиназы) инактивирован мутациями разного типа: делециями (например участка ДНК между 2 сайтами Narl), вставками чужеродной ДНК или делецией и вставкой. Эти мутанты не продуцируют функциональную ТК и являются аттенуиро-ванными. В ген ТК вируса ИЛТ можно встраивать гетерологичные гены,кодирующие АГ патогенов птиц: вирусов БМ, НБ, ИБК, ретровирусов и т.д. Такие Варианты вируса ИЛТ можно использовать в качестве вакцинных векторов,индуцирующих иммунный ответ. Получен положительный результат при использование для специфической профилактики ИЛТ очищенного афинной хроматографией гликопротеина.
Оценка поствакцинального иммунитета. Куры, переболевшие инфекционным ларинготрахеитом, в естественных условиях приобретают практически пожизненный иммунитет. Установлено, что двукратная ассоциированная аэрозольная иммунизация птиц против НБ, ИЛТ и оспы не угнетает клеточных и гуморальных показателей иммунитета. Большинство исследователей поствакцинальный иммунитет оценивают по уровню ВНА, а напряженность - путем контрольного заражения.Установлена тесная корреляция между напряженностью иммунитета и титром в первые 2 недели после вакцинации. В ряде случаев цыплята могут быть устойчивы к заражению, но серонегативны, что свидетельствует о том, что иммунное состояние наступает раньше, чем появляются AT в крови.
В сыворотках крови вакцинированных кур на 10-14-й дн обнаруживают ВНА. В небольших титрах они у птиц выявлялись в РН через 55 нед после вакцинации. Установлена прямая зависимость между уровнем защиты кур после вакцинации и титрами ВНА. При титре поствакцинальньгх антител Г 76, Мб, 1:10и Г8 процент заболеваемости птицы после экспериментального заражения составлял 0,45, 55 и 100% соответственно. Птица, иммунизированная клоачно, не заболевает при интратрахеальном заражении, а выжившая после интратрахеальной вакцинация остается невосприимчивой при заражении в клоаку. В связи с этим поствакцинальный иммунитет оценивают по наличию ВНА в сыворотке крови вакцинированных кур, а также по результатам биопробы (клоачная реакция). Для ориентировочной оценки напряженности иммунитета птиц после вакцинации против ИЛТ можно использовать РДП и РИЭФ, но они менее показательны. Связь титров AT с вирусоносительством и вирусовыделением не изучена.
Пассивный иммунитет. Заражение 1-дневных цыплят, полученных от вакцинированных птиц, приводило к 40%-ной заболеваемости и смертности; гибель цыплят, полученных от не иммунных родителей, составляла 100%. Куры,содержащие ВНА в титре 1:76 не защищают потомство и в организме их возможна репродукция вируса в раннем возрасте.
Разделы:
Комментарии